Dreidimensionale Visualisierung einer Tollwutvirusinfektion im Hirngewebe von Mäusen

Nehmen Sie einen fixierten, dicken Gehirnschnitt von einer Maus, die mit dem Tollwutvirus infiziert ist.

Das Virus infiziert Neuronen und repliziert sich, was dazu führt, dass virale Proteine in den Zellen vorhanden sind.

Mit einem Detergens zur Permeabilisierung der Zellmembranen und einer Blockierungslösung zur Maskierung unspezifischer Bindungsstellen behandeln.

Inkubieren Sie mit primären Antikörpern, die auf die viralen Proteine abzielen, gefolgt von Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern, die an die primären Antikörper binden.

Mit einem fluoreszierenden Nukleinsäure-bindenden Farbstoff behandeln, um den Zellkern zu markieren.

Dehydrieren Sie das Gewebe bei steigenden Alkoholkonzentrationen und tragen Sie dann eine Reinigungslösung auf, um die Gewebetransparenz für die Bildgebung zu erhöhen.

Montieren Sie den Schnitt in einer Bildgebungskammer, füllen Sie ihn mit der Reinigungslösung und versiegeln Sie ihn.

Mit der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie wird das Gewebe separat mit den Fluoreszenzmarkierungen abgebildet und dann zu einem zweidimensionalen Bild zusammengeführt.

Erfassen Sie Bilder in verschiedenen Fokusebenen des Gewebes und kombinieren Sie sie, um eine dreidimensionale Darstellung zur Bewertung des Infektionsverlaufs zu erstellen.

Für die Immunfärbung der Hirngewebeschnitte waschen Sie die Proben zweimal 1 Stunde lang in 4 Millilitern 0,2 % Triton X-100 in PBS, gefolgt von einer zweitägigen Permeabilisierung bei 37 Grad Celsius, in 4 Millilitern 0,2 % Triton X-100, 20 % Dimethylsulfoxid und 0,3 molar Glycin in PBS. Blockieren Sie jede unspezifische Bindung mit 4 Millilitern 0,2 % Triton X-100, 10 % Dimethylsulfoxid und 6 % normalem Serum in PBS für zwei Tage bei 37 Grad Celsius.

Am Ende der Blockierungsinkubation werden die Proben fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius mit 2 Millilitern Primärantikörperlösung markiert und die Antikörperlösung nach zweieinhalb Tagen aufgefrischt. Waschen Sie die Proben anschließend einen Tag lang in 4 Millilitern 0,2 % Tween 20 und 10 Mikrogramm pro Milliliter Heparin in PBS, wechseln Sie den Waschpuffer mindestens vier- bis fünfmal im Laufe des Tages und lassen Sie die letzte Wäsche über Nacht einwirken.

Am nächsten Tag inkubieren Sie die Proben fünf Tage lang in 2 Millilitern Sekundärantikörperlösung bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie dann die Proben in 4 Millilitern frischem 0,2 % Tween 20 und 10 Mikrogramm pro Milliliter Heparin in PBS, wie gezeigt.

Für die Kernfärbung der Proben inkubieren Sie die Proben in 4 Millilitern des Nukleinsäurefärbemittels TO-PRO-3 für 5 Stunden lichtgeschützt. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Proben in 0,2 % Tween 20 und 10 Mikrogramm pro Milliliter Heparin in PBS, wie gezeigt, gefolgt von einer Dehydratisierung in einer aufsteigenden tert-Butanol-Serie für 2 Stunden pro Immersion.

Nach dem 90%igen Eintauchen werden die Proben über Nacht in eine 96%ige tert-Butanol-Lösung überführt. Am nächsten Morgen werden die Proben weiter in 100% tert-Butanol für 2 Stunden dehydriert, bevor die Gewebeschnitte in frisch aufbereitetem BABB-D15 für 2 bis 6 Stunden freigegeben werden, bis sie optisch transparent sind. Die Proben können dann bis zu ihrer Montage und Bildgebung lichtgeschützt im BABB-D15 gelagert werden.

Verwenden Sie für die Probenmontage einen 3D-Drucker, um eine Bildgebungskammer und einen Deckel zu drucken. Montieren Sie ein Deckglas mit einem Durchmesser von 30 Millimetern mit einer Komponente vulkanisierendem Silikonkautschuk bei Raumtemperatur auf die Bildgebungskammer. Montieren Sie auf ähnliche Weise ein 22-Millimeter-Deckglas auf dem Deckel. Verwenden Sie ein wasserbenetztes Wattestäbchen, um den überschüssigen Silikonkautschuk an beiden Ringen zu entfernen, bevor Sie den Gummi über Nacht aushärten lassen.

Legen Sie am nächsten Tag eine Probe in die Bildgebungskammer und geben Sie ein kleines Volumen BABB-D15 in die Kammer, bevor Sie den Deckel einsetzen. Füllen Sie die Kammer mit einer Injektionsnadel mit BABB-D15 durch den Einlass und verschließen Sie den Einlass, bevor Sie die Bildgebungskammer mit Silikonkautschuk verschließen.

Um die Bildaufnahme einzurichten, wählen Sie die geeigneten Laserlinien für die verwendeten Fluorophore aus und passen Sie die Erfassungsbereiche jedes Detektors an, um eine Signalüberlappung zwischen den Kanälen zu vermeiden. Legen Sie dann die Aufnahmeparameter fest, definieren Sie den oberen und unteren Rand des Stapels und erfassen Sie den Bildstapel.

Um 3D-Projektionen des Bildstapels zu generieren, öffnen Sie die Bilddateien in Fidschi und wählen Sie Bild, Farbe, Kanalwerkzeug, Mehr und Kanäle teilen, um die zusammengeführten Bilder in einzelne Kanäle aufzuteilen. Für die Bleichkorrektur der Bilder für jeden Kanal wählen Sie Bild, Anpassen, Bleichkorrektur und wählen Sie Einfaches Verhältnis. Verwenden Sie die Schieberegler, um die Helligkeit und den Kontrast für jeden Kanal anzupassen, und wählen Sie "Bild", "Farbe" und "Kanäle zusammenführen" aus. Aktivieren Sie die Option Komposition erstellen.

Konvertieren Sie das Bild in das RGB-Format und wählen Sie Bild, Stapel und 3D-Projekt aus, um eine 3D-Projektion zu generieren. Wählen Sie den hellsten Punkt als Projektionsmethode und stellen Sie den Schichtabstand so ein, dass er der Z-Schritt-Größe des erfassten Bildstapels entspricht. Für maximale Qualität setzen Sie das Inkrement des Drehwinkels auf 1 und aktivieren Sie die Interpolation. Ändern Sie die Schwellenwerte für die Gesamtdrehung, die Transparenz und die Deckkraft nach Bedarf. Speichern Sie dann die 3D-Projektion sowohl als . TIFF- und .AVI Dateiformate.