Visualisierung von Motoneuronenprojektionen und Axonverzweigungen mit Hilfe der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie

Nehmen Sie ein chemisch fixiertes und gereinigtes Gewebesegment von einem transgenen Mausembryo, der grün fluoreszierendes Protein (GFP) in spinalen Motoneuronen exprimiert.

Montieren Sie das Gewebe vertikal auf eine modifizierte Pipettenspitze.

Befestigen Sie die Spitze an einer Kapillare, die im Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop befestigt ist.

Platzieren Sie eine mit Puffern gefüllte Probenkammer unter dem Gewebe, um es einzutauchen und Ablagerungen zu entfernen.

Richten Sie das Gewebe mit Hilfe einer Bildgebungssoftware im Strahlengang aus.

Beginnen Sie mit der Bildaufnahme.

Die Lichtquelle sendet eine dünne Schicht Laserlicht aus, die GFPs in einer einzigen Ebene des Gewebes anregt, um Fluoreszenz zu emittieren.

Ein senkrecht zum Strahlengang positionierter Detektor erfasst die emittierte Fluoreszenz.

Erfassen Sie Bilder der spinalen Motoneuronen, um eine 3D-Rekonstruktion der axonalen Verzweigungsmorphologie zu erstellen.

Verwenden Sie Software zur Kartierung von Axonen, zur Identifizierung von Verzweigungsmustern und Endpunkten, um das Wachstum und die Konnektivität von Motoneuronen zu beurteilen.

Richten Sie 5X/0,1 Beleuchtungsoptiken und 5X/0,16 Detektionsoptiken ein. Montieren Sie den Probenhalter und die Probenkapillare. Bereiten Sie die Probenkammer vor, indem Sie sie mit Reinigungslösung füllen. Um den Embryo zu montieren, bereiten Sie eine P200-Pipettenspitze vor, indem Sie den oberen Teil so abschneiden, dass er dem Durchmesser der Kapillare entspricht, und den spitzen Teil für den Probenaufsatz entfernen.

Schmelzen Sie dann das abgestumpfte Ende der Pipettenspitze mit einer kleinen Flamme. Löschen Sie die Flamme und befestigen Sie den Embryo schnell senkrecht am geschmolzenen Ende. Setzen Sie den oberen Teil der Pipettenspitze in die Probenkapillare ein und setzen Sie die vorbereitete Probenkammer in das Mikroskop ein. Wählen Sie mit der Imaging-Software auf der Registerkarte "Lokalisieren" die Option "Kapillare lokalisieren" und passen Sie die xy- und z-Achsen an.

Wählen Sie als Nächstes Probe lokalisieren und zoomen Sie auf das 0,6-fache, um sich auf den Embryo zu fokussieren. Lassen Sie den Kammerpuffer einige Zeit mit dem Embryo ausgleichen, um Ablagerungen oder Blasen zu entfernen. Definieren Sie für die Bildaufnahme auf der Registerkarte Erfassung die Strahlengangparameter, z. B. Detektionsobjektive, Laserblocking-Filter, Strahlteiler, Kameras und Laser.

Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für den Pivot-Scan für die Schattenreduzierung. Definieren Sie dann die Erfassungseinstellungen, Bittiefe bis 16 Bit. Zoomen Sie auf den Bereich zwischen 0,36 und 0,7X einseitiger Beleuchtung oder beidseitiger Beleuchtung. Klicken Sie auf Kontinuierlich und legen Sie die Laserintensität, die Belichtungszeit, die Laserleistung und die Position des Lichtblatts fest. Drücken Sie anschließend Stopp, um die Bildaufnahme zu beenden.

Es ist wichtig sicherzustellen, dass die transparente Probe innerhalb des kürzesten Strahlengangs positioniert ist, um detaillierte Bilder von feinen aufrechten Strukturen auf einzelnen motorischen Nerven aufnehmen zu können.

Definieren Sie für die mehrdimensionale Erfassung den Z-Stapel, indem Sie die Z-Position für das erste und letzte Bild verschieben. Klicken Sie auf Optimal, um die Segmentnummer festzulegen. Klicken Sie dann auf Experiment starten, um den ausgewählten Z-Stack abzurufen. Wenn dies erledigt ist, speichern Sie das Bild im dot CZI-Format.

Um die Axonverbarrung zu quantifizieren, öffnen Sie die Bilddatei in der Bildgebungsanalysesoftware. Passen Sie die Bildfarbe, Helligkeit und den Kontrast mithilfe des Anzeigeanpassungsfensters an, um Filamente basierend auf dem lokalen Intensitätskontrast zu erkennen. Klicken Sie anschließend auf das Symbol Neue Filamente hinzufügen und wählen Sie den Auto-Path-Algorithmus im Dropdown-Menü aus. Wählen Sie den gewünschten Bereich aus.

Definieren Sie dann die Start- und Kernpunkte, indem Sie die größten und dünnsten Durchmessermaße zuweisen, die im Schichtmodus gemessen werden können. Weisen Sie einen Startpunkt am Rand des Interessenbereichs zu. Um das manuelle Hinzufügen oder Entfernen von Startpunkten zu erreichen, ändern Sie zuerst den Zeigermodus, wählen Sie Navigieren, und klicken Sie dann mit der Umschalttaste und der rechten Maustaste auf die Points of Interest.

Wählen Sie als Nächstes Manuelle Schwellenwerte für Kernpunkte aus, um sicherzustellen, dass die gesamte sichtbare Baumbildung markiert ist. Fügen Sie dann Kernpunkte manuell hinzu oder entfernen Sie sie. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Getrennte Segmente entfernen und Kernpunkte um Startpunkte entfernen. Passen Sie anschließend den Schwellenwert für die Hintergrundsubtraktion an und beenden Sie den Vorgang.

Es ist notwendig, Hintergrundartefakte zu entfernen und zu bestätigen, dass der Detektorpfad die echte Axonverbarrung widerspiegelt, um eine genaue Quantifizierung zu gewährleisten.

Wählen Sie am Ende den gewünschten Stil und die gewünschte Farbe aus. Wählen Sie auf der Registerkarte Statistik die Option Detailliert aus, und verwenden Sie die Dendriten-Endpunkte der Filamentanzahl, um die motorischen Nervenendigungen als Indikator für die Verbarrung des motorischen Axons zu quantifizieren. Exportieren Sie dann das Bild des rekonstruierten Axons als . TIFF-Datei.