Histochemische Bildgebung von kortikalen Modulen in abgeflachten Hirnschnitten

Beginnen Sie mit vorfixierten tangentialen Abschnitten der abgeflachten kortikalen Abschnitte des Gehirns. Waschen Sie, um Fixiermittelspuren zu entfernen.

Färben Sie die Schnitte mit einer Lösung aus Diaminobenzidin oder DAB und Nickel-Ammoniumsulfat.

DAB diffundiert in kortikale Neuronen und reagiert in den Mitochondrien mit Cytochromoxidase, wobei ein dunkler Niederschlag entsteht. Nickel-Ammoniumsulfat verdunkelt den Niederschlag und erhöht den Kontrast.

Fügen Sie Paraformaldehyd hinzu, um die Fleckenreaktion zu stoppen, und spülen Sie es dann aus.

Montieren Sie die Abschnitte auf einen Objektträger und trocknen Sie sie mit Ethanol aus.

Spülen Sie mit Isopropanol und Xylol, um den Abschnitt zu reinigen und die Lichtdurchlässigkeit zu verbessern.

Tragen Sie ein Eindeckmedium auf und kleben Sie ein Deckglas darauf.

Wenn es unter einem Hellfeldmikroskop aufgenommen wird, absorbieren und streuen die Ausfällungen in den kortikalen Neuronen Licht, wodurch sie dunkel erscheinen.

Im Gegensatz dazu lassen ungebeizte, freiliegende Flächen Licht durch und wirken hell.

Dieser Kontrast hebt kortikale Module als dunkle, fleckige Strukturen vor einem helleren Hintergrund hervor, die aktive neuronale Cluster darstellen, die an der Verarbeitung sensorischer Informationen beteiligt sind.

Waschen Sie das Schnitttuch 15 Minuten lang in HEPES-Puffer unter leichtem Rühren. Bereiten Sie während des Waschvorgangs frische Cytochromoxidase-Färbelösung vor und fügen Sie die DAB-Komponente hinzu, kurz bevor Sie sie verwenden. Inkubieren Sie nun die Abschnitte in der frisch hergestellten Färbelösung bei Raumtemperatur mit einem Shaker. Und halten Sie Wache. Abhängig von der Menge der Fixierung kann die Färbung in 10 Minuten oder mehrere Stunden beobachtbar sein.

Wenn die Reaktion zu langsam abläuft, erhöhen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius. Um die Reaktion zu stoppen, werden die Schnitte in ein Bad mit 4 % PFA überführt und 15 Minuten lang unter leichtem Rühren inkubiert. Waschen Sie dann die Abschnitte dreimal 10 Minuten lang pro Waschgang mit HEPES-Puffer.

Montieren und trocknen Sie nun die Abschnitte auf Objektträgern und trocknen Sie sie mit zunehmend stärkeren Ethanolbädern. Waschen Sie dann die Objektträger 5 Minuten lang in Isopropanol, gefolgt von Xylol für fünf Minuten. Nach dem Xylolbad sofort ein schnell aushärtendes, nicht wasserbasiertes Einbettmittel hinzufügen. Medien auf Wasserbasis zersetzen den Fleck. Lagern Sie die Objektträger nach dem Hinzufügen eines Deckglases bei 4 Grad Celsius, bis sie abgebildet sind.