Analyse von Immunzellen im Nervengewebe der Maus mittels Durchflusszytometrie

Man nehme Zellen, die aus Ischiasnerven der Maus und Spinalganglien oder DRGs isoliert wurden.

Inkubiere mit Fluorophor-markierten Antikörpern gegen CD45 und CD11b und mit Biotin-markierten Antikörpern gegen MHC Klasse II, um Immunzellen zu markieren.

Inkubieren Sie mit Fluorophor-markiertem Streptavidin, das an Biotin bindet.

Mit einem Fixiermittel behandeln, um die Zellstruktur zu stabilisieren.

Führen Sie einen Permeabilisierungspuffer mit einer fluoreszierenden DNA-Färbung ein, um die Membranen zu permeabilisieren und die Zellkerne zu markieren.

Führen Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer durch den Laserstrahl, um die optischen und Fluoreszenzeigenschaften zu beurteilen.

Entfernen Sie Aggregate mit einer höheren DNA-Fluoreszenz, um einzelne Zellen zu isolieren und die Fluoreszenz von den Markern zu detektieren.

Identifizieren Sie Zellen, die CD45 exprimieren, einen charakteristischen Marker von Immunzellen, und bestätigen Sie deren Vorhandensein.

Die meisten CD45-positiven Zellen im DRG exprimieren CD11b und MHC Klasse II, was auf mikrogliaähnliche Zellen hinweist, die in den Ischiasnerven fehlen.

Diese Technik ergänzt die Bildgebung zur Analyse der Heterogenität von Immunzellen im Nervengewebe.

Wählen Sie am Computer die geeigneten Kanäle für die Detektion der interessierenden Fluorophore, die geeignete Flussrate für die Proben und die Gesamtzahl der pro Probe zu erfassenden Ereignisse aus. Die Mindestanzahl der Ereignisse sollte 1 Million betragen.

Erstellen Sie als Nächstes Streudiagramme unter einem globalen Arbeitsblatt für den Seitenstreuer A im Vergleich zum Vorwärtsstreu A sowie für jedes Fluorophor von Interesse im Vergleich zum Vorwärtsstreu A. Erstellen Sie außerdem eine Statistikansicht, in der die Anzahl der Ereignisse und die mittlere Fluoreszenzintensität für die ausgewählten Fluorophore angezeigt werden.

Bestimmen Sie das übergeordnete Gate P1 basierend auf dem Streudiagramm von reinen DAPI-Färbesteuerungen. Hängen Sie die Probe an die Durchflusszytometrie an und klicken Sie auf Erfassen. Beobachten Sie das Diagramm DAPI versus FSC, und reduzieren Sie die Spannung des DNA-Pazifikblau-Kanals, bis die DAPI-plus-Population sichtbar wird. Zeichnen Sie mit dem Rechteck-Gating-Tool einen Quader um die DAPI-plus-Population. Dies stellt das P1-Gatter dar. Wählen Sie die Streudiagramme für jedes der Fluorophore aus, und zeigen Sie nur die DAPI-plus-Ereignisse an. Dies stellt die Hintergrundfluoreszenz für jedes der Fluorophore dar.

Zeichnen Sie mit dem Rechteck-Gating-Werkzeug für jedes der Fluorophore einen Quader in den Streudiagrammen, beginnend bei 103 auf der y-Achse. Dieses Gate stellt den Bereich dar, in dem positive Ereignisse für jeden der angegebenen Marker gefunden werden sollten. Passen Sie die Spannungen für jedes der Fluorophore mit den reinen DAPI-Färbereglern an. Hängen Sie die Probe an die Durchflusszytometrie an und klicken Sie auf Erfassen.

Beobachten Sie die Position der DAPI-plus-Population für jedes der Fluorophore und passen Sie die jeweiligen Spannungen so an, dass die Populationen außerhalb des Rechteckgatters liegen. Sobald das Durchflusszytometer eingerichtet ist, führen Sie die Proben aus und exportieren Sie die Forward-Scatter-Dateien zur weiteren Analyse.