JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 2:59 Min. • May 29th, 2025
Nehmen Sie einen Membraneinsatz, der transduzierte embryonale organotypische Hirnschnitte der Maus enthält, in denen Neuronen und radiale Gliazellen fluoreszierende Proteine exprimieren, die ihre Visualisierung ermöglichen.
Wählen Sie mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie eine Schicht mit fluoreszierenden kortikalen Neuronen aus, die radial zur Pialoberfläche der Schicht wandern, indem Sie intakte radiale Gliagerüste verwenden.
Übertragen Sie den Membraneinsatz mit der ausgewählten Scheibe in eine Glasbodenschale mit einem Medium, um die Zellaktivität während der Bildgebung zu unterstützen.
Stellen Sie die Schale in die klimatisierte Kammer des inversen Konfokalmikroskops, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten.
Passen Sie die Bildgebungsparameter an, um klare Bilder aufzunehmen und gleichzeitig Lichtschäden zu minimieren.
Konfigurieren Sie als Nächstes einen Z-Stack in der Zielregion, um zelluläre Strukturen zu visualisieren.
Starten Sie die Zeitraffer-Bildgebung in regelmäßigen Abständen.
Analysieren Sie die Bilder, um die radiale Migration der kortikalen Neuronen von der subventrikulären Zone zur kortikalen Platte entlang radialer Gliagerüste zu beurteilen und die neuronalen Migrationsmuster hervorzuheben.
Wählen Sie einen Gehirnschnitt für die Bildgebung aus, indem Sie die Schnitte durch ein inverses Mikroskop betrachten. Wählen Sie eine Schicht mit hellen einzelnen Neuronen in der oberen SVZ, die radial zur pialen Oberfläche der Schicht wandern.
Das Vorhandensein feiner fluoreszierender Prozesse radialer Gliazellen, die sich über die gesamte kortikale Platte erstrecken, deutet auf ein intaktes radiales Gliagerüst hin, das von migrierenden kortikalen Neuronen genutzt wird.
Übertragen Sie den Membraneinsatz mit einer ausgewählten Scheibe in eine Glasbodenschale mit einem Durchmesser von 50 Millimetern mit 2 Millilitern Scheibenkulturmedium. Stellen Sie die Schale in die Klimakammer des Konfokalmikroskops.
Stellen Sie die Auflösung auf 512 x 512 Pixel ein. Erhöhen Sie die Scangeschwindigkeit von 400 Hertz auf 700 Hertz, um die Bildrate von etwa 1,4 auf etwa 2,5 Bilder pro Sekunde zu erhöhen. Verwenden Sie nicht mehr als die zweifache Mittelwertbildung.
Definieren Sie einen Z-Stapel durch den elektroporierten Bereich mit einer Schrittweite von 1,5 Mikrometern. Starten Sie die Zeitrafferserie, indem Sie alle 30 Minuten einen Z-Stapel erstellen. Die beschriebenen Einstellungen ermöglichen eine ausreichende Auflösung und Helligkeit des Bildes bei gleichzeitiger Minimierung von Lichtschäden während der Aufnahme.