Duale Fluoreszenzbildgebung zur Identifizierung differenzierter Oligodendrozyten

Nehmen Sie eine Kultur von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs), die aus dem Gehirn eines Rattenwelpen isoliert wurden und dazu gebracht wurden, sich in Oligodendrozyten zu differenzieren. Die Zellen sind fixiert, um die Zellarchitektur zu erhalten.

Differenzierte Oligodendrozyten exprimieren das Myelin-Basisprotein (MBP), einen Marker für reife Oligodendrozyten, während sowohl OPCs als auch differenzierte Zellen den Oligodendrozyten-Transkriptionsfaktor 2 oder Olig2 exprimieren.

Tragen Sie eine Permeabilisierungs-blockierende Lösung auf und inkubieren Sie unter Rühren, wodurch die Zellmembranen permeabilisiert und unspezifische Bindungsstellen blockiert werden.

Fügen Sie primäre Antikörper hinzu, die auf die Marker abzielen, und inkubieren Sie unter Rühren, um eine Bindung zu ermöglichen.

Waschen Sie, um ungebundene Antikörper zu entfernen, fügen Sie dann verschiedene Fluorophor-konjugierte Sekundärantikörper hinzu, die für die primären Antikörper spezifisch sind, und inkubieren Sie unter Rühren.

Waschen Sie die Zellen und legen Sie sie dann in ein duales Fluoreszenzbildgebungssystem.

Verwenden Sie Licht bestimmter Wellenlängen, um die unterschiedlichen Fluorophore anzuregen und die emittierten Signale zu detektieren, um die Marker sichtbar zu machen.

Differenzierte Oligodendrozyten, die Olig2 und MBP exprimieren, unter den undifferenzierten OPCs, die nur Olig2 exprimieren, zu identifizieren.

Bringen Sie die Platte auf Raumtemperatur. Aspirieren Sie die Vertiefungen und fügen Sie 250 Mikroliter DPBS mit 5 % NGS und 0,1 % Triton X-100 hinzu. Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Orbitalschütteln. Bereiten Sie die primäre Inkubationslösung vor, indem Sie den monoklonalen Anti-MBP-Antikörper der Maus und den polyklonalen Anti-OLIG2-Antikörper des Kaninchens in DPBS mit 5 % NGS verdünnen. Dann inkubieren Sie die primären Antikörper über Nacht 16 bis 18 Stunden lang bei 4 Grad Celsius unter leichtem Orbitalschütteln.

Bereiten Sie beim Waschen der Platte die sekundäre Inkubationslösung vor, indem Sie die Anti-Maus-680- und Anti-Kaninchen-800-Antikörper in DPBS mit 5 % NGS verdünnen. Als nächstes aspirieren Sie die letzte Wäsche und fügen Sie 250 Mikroliter sekundäre Inkubationslösung hinzu. Schützen Sie die Platte vor Licht und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schwingen.

Scannen Sie danach die Platte mit einem bildgebenden System, das Fluoreszenzemissionen von 700 Nanometern und 800 Nanometern nachweisen kann. Legen Sie als Ausgangspunkt den Fokusversatz auf 3 und die Sensitivitäten auf 1,5 für MBP, 5,0 für Aktin und 3,5 für OLIG2 fest. Passen Sie die Empfindlichkeitswerte nach Bedarf an, um eine Überbelichtung des Signals zu vermeiden.