Messung der Proteinexpression im Nagetiergehirn mittels Nahinfrarot-Fluoreszenz und hochauflösender Abtastung

Nehmen Sie einen Objektträger mit Gewebeschnitten des Gehirns von Ratten, die immungefärbt auf AMPA- und NMDA-Rezeptoren in Amygdala-Neuronen sind.

AMPA-Rezeptoren vermitteln den Glutamat-induzierten Natriumeinstrom und die schnelle exzitatorische synaptische Übertragung.

Im Gegensatz dazu vermitteln NMDA-Rezeptoren den Glutamat- und Co-Agonisten-induzierten Natrium- und Calciumeinstrom, was eine langsame exzitatorische synaptische Übertragung ermöglicht.

Die Rezeptoren werden mit Primärantikörpern gefärbt und mit Nahinfrarot-Fluorophor-markierten Sekundärantikörpern nachgewiesen.

Legen Sie den Objektträger mit der Gewebeseite nach unten auf die Nahinfrarot-Scanschnittstelle.

Passen Sie die Bildgebungsparameter an und beginnen Sie mit der Bildgebung.

Bei der Laserbeleuchtung emittieren die Fluorophore an den AMPA- und NMDA-Rezeptoren Fluoreszenz.

Die Nahinfrarot-Bildgebung minimiert die Autofluoreszenz und verbessert die Signalklarheit.

Die hochauflösende Abtastung sorgt außerdem für eine klare Unterscheidung der Fluoreszenzsignale und ermöglicht eine präzise Visualisierung von nahegelegenen AMPA- und NMDA-Rezeptoren in der Amygdala.

Berechnen Sie mit Hilfe einer Bildgebungssoftware das AMPA/NMDA-Fluoreszenzintensitätsverhältnis in einer bestimmten Region von Interesse als Marker für Lernen und Gedächtnis.

Platzieren Sie die Objektträger mit dem Gewebe nach unten auf der Nahinfrarot-Scanfläche. Stellen Sie mehrere Folien gleichzeitig mit einem Auswahlwerkzeug dar. Stellen Sie die Folien mit der höchsten Qualitätseinstellung mit einer Auflösung von 21 Mikrometern dar. Importieren Sie Bilder in einem Versatz von 0 Nanometern in die Bildanalysesoftware, um sie anzuzeigen und für die semiquantitative Proteinanalyse zu markieren.

Wählen Sie nach dem Öffnen der Bildanalysesoftware den Arbeitsbereich aus, in den das Bild gescannt wurde. Öffnen Sie dann das gescannte Bild in der Bildanalysesoftware, um den Scan anzuzeigen und Wellenlängen, Kontrast, Helligkeit und Vergrößerung anzupassen, ohne das Rohbild oder die gesamte quantifizierte Emission zu verändern.

Nachdem Sie die Schlüsselbereiche für die Quantifizierung identifiziert haben, wählen Sie oben auf der Seite die Registerkarte Analyse und dann Rechteck zeichnen, um ein Rechteck über den Bereich zu zeichnen, der quantifiziert werden soll. Um die Rechteckgröße anzuzeigen, wählen Sie unten links auf dem Bildschirm Formen aus. Wählen Sie dann unten rechts Spalten aus. Fügen Sie dann die Spalten "Höhe" und "Breite" hinzu, um die Größe der Form zu identifizieren. Benennen Sie abschließend die Form, und wiederholen Sie den Vorgang. Nachdem alle Regionen erfasst wurden, fahren Sie mit dem Kombinieren und Analysieren der auf der Registerkarte Spalten verfügbaren Daten fort.