Visualisierung der Mitochondrien innerhalb der intraepidermalen Nervenfasern

Beginnen Sie mit einem epidermalen Hautgewebeschnitt, der intraepidermale Nervenfasern oder IENFs enthält, dünne sensorische Neuronenenden.

Die IENFs sind reich an Mitochondrien und liefern Energie für die Signalübertragung von Neuronen.

Das Gewebe hat fluoreszenzmarkierte IENFs, Mitochondrien und epidermale Kerne.

Mit einem inversen konfokalen Mikroskop erfassen Sie sequentiell diskrete Fluoreszenzsignale bei geeigneten Wellenlängen für die Zellkerne, IENFs und Mitochondrien.

Aktivieren Sie einen Live-Scan, um das IENF-Signal zu erfassen, das die Epidermisschicht umfasst.

Führen Sie dann eine sequenzielle Abtastung für jedes Signal durch, um das Übersprechen von Fluoreszenzsignalen zu vermeiden.

Schneiden Sie aus dem kombinierten Bild mit der Software die blau fluoreszierenden Epidermiszellen zu und isolieren

Sie sie.

Bearbeiten Sie dann den beschnittenen Bereich, um die Auflösung der grünen IENF-Signale und der roten mitochondrialen Signale zu verbessern.

Generieren Sie als Nächstes ein 3D-Oberflächenbild, um eine Maske für IENFs zu erstellen, und überlagern Sie dann das mitochondriale Oberflächenbild, um nervenspezifische Mitochondrien zu isolieren.

In der endgültigen Ausgabe erscheinen IENFs in Cyan, während die Mitochondrien als winzige magentafarbene Strukturen erscheinen.

Wählen Sie das 40-fach-Öl-Immersionsobjektiv an einem konfokalen Invers-Laser-Scanning-Mikroskop. Wählen Sie die geeigneten Laser und Detektoren aus, um die Zellkerne, Nervenfasern und Mitochondrien abzubilden. Geben Sie die folgenden Scanparameter in die Mikroskopsoftware ein: 12-Bit-Intensitätsauflösung. Abtastrate von 600 Hz mit Zwei-Frame-Mittelung und Zoom von 2,2. Stellen Sie die Mikroskopsoftware auf eine optimierte laterale Auflösung ein, indem Sie eine Scanauflösung von 1024 x 1024 auswählen. Optimieren Sie die axiale Auflösung und die optische Schnittbildung, indem Sie eine konfokale Apertur von einer luftigen Einheit mit einer Z-Schrittgröße von 210 Nanometern auswählen.

Scannen Sie jedes Signal separat und passen Sie die Detektorspannung und den Offset an, um über- und untersättigte Pixel zu entfernen. Aktivieren Sie einen Live-Scan für das Nervensignal und passen Sie den Z-Fokusregler an, um die obere und untere Brennebene in der Mikroskopsoftware zu finden und einzustellen, die das Nervensignal innerhalb des Gewebeschnitts umfasst. Scannen Sie die endgültige z-Serie mit sequenzieller Abtastung, um das Übersprechen von Fluoreszenzsignalen zu vermeiden.

Isolieren Sie die Epidermis vom Stratum corneum und der Dermis, indem Sie eine Region um die Epidermis zeichnen, indem Sie mit einem Auswahlwerkzeug ein dupliziertes Bild des Originalbildes verwenden. Schneiden Sie dann das Bild auf die Auswahl zu. Berechnen Sie die Punktspreizungsfunktionen für die konfokalen grünen und roten Fluoreszenzsignale mit der Funktion "Streuung berechnen". Stellen Sie dann die Parameter für den mittleren Brechungsindex für Öl auf 1,515 und die numerische Apertur für das 40-fache Ölobjektiv auf 1,25 ein. Stellen Sie die Lochblende des Detektors auf einen Bereich und eine Einheit ein und wählen Sie eine Laseranregungswellenlänge.

Verwenden Sie eine iterative Wiederherstellung mit einer Konfidenz von 100 %, einem Iterationslimit von 10 Zyklen und den grünen und roten PSFs für die Entfaltung der grünen und roten Fluoreszenzsignale. Verwenden Sie das Werkzeug Oberfläche erstellen, um eine Oberfläche um die entfalteten Nervensignale zu erstellen, indem Sie das ungeprüfte glatte Feature, die absolute Intensität für die Schwellenwertsetzung, einen unteren Schwellenwert von 3.000 und einen oberen Schwellenwert von 65.535 auswählen. Halten Sie die Oberflächen über 10 Voxel.

Entfernen Sie die Nicht-Nervenoberflächen, indem Sie auf der Registerkarte Bearbeiten in der Nervenoberfläche einzelne Nicht-Nervenoberflächen auswählen, oder halten Sie die Strg-Taste gedrückt, um mehrere Nicht-Nervenoberflächen auszuwählen. Löschen Sie die ausgewählten Nicht-Nervenflächen, indem Sie die Entf-Taste drücken. Verwenden Sie die Registerkarte Bearbeiten in der Nervenoberfläche und klicken Sie auf die Schaltfläche Alle maskieren in den Maskeneigenschaften.

Wählen Sie im neuen Fenster unter der Kanalauswahl die Option Kanal 5 Mitochondria Deconvolved aus und aktivieren Sie dann Kanal duplizieren, bevor Sie die Maske anwenden. Drücken Sie das Optionsfeld für konstant innen außen, und überprüfen Sie, ob die Voxel Außenfläche auf 0,0 eingestellt sind. Drücken Sie die OK-Taste.

Erstellen Sie abschließend mitochondrienspezifische Oberflächen mit dem Werkzeug Oberfläche erstellen, um eine Oberfläche um die maskierten entfalteten mitochondrialen Signale zu erstellen, indem Sie die deaktivierte Funktion "Glätten" auswählen und die Hintergrundsubtraktion für die Schwellenwertbestimmung verwenden. Legen Sie den Durchmesser der größten Kugel auf 1,50 Mikrometer, den unteren Schwellenwert auf 2.000 und den oberen Schwellenwert auf maximal 65.535 Mikrometer fest. Achten Sie darauf, die Oberflächen über 1,0 Voxel zu halten.