Live-Bildgebung der Ziliaraktivität von Ependymzellen in einem Schnitt aus dem Gehirn einer Maus

Nehmen Sie einen sagittalen Schnitt eines Mäusegehirns, um die Ventrikel freizulegen, bei denen es sich um Hohlräume handelt, die mit Liquor cerebrospinalis (CSF) gefüllt sind.

Die Ependymzellen, die die Ventrikel auskleiden, besitzen bewegliche Flimmerhärchen, die den Liquor antreiben, um seine Durchblutung zu erleichtern.

Legen Sie den Schnitt in eine Glasbodenschale, die ein nährstoffreiches Medium enthält, um die Ziliaraktivität aufrechtzuerhalten.

Übertragen Sie die Schüssel in die klimatisierte Kammer eines DIC-Mikroskops, um die Lebensfähigkeit der Zellen während der Bildgebung zu erhalten.

Bei der DIC-Mikroskopie wird polarisiertes Licht mit einem Prisma gespalten und auf verschiedene Wege durch die Probe gelenkt.

Schwankungen des Brechungsindex über die Probe führen zu Phasenunterschieden zwischen den Strahlen.

Ein zweites Prisma kombiniert die Strahlen neu und erzeugt so Interferenzen, die ein kontrastreiches Bild mit dreidimensionalem Effekt erzeugen und die Sichtbarkeit feiner Strukturen verbessern.

Lokalisieren Sie funktionelle Ependymzellen mit beweglichen Zilien, indem Sie die Blasenbewegung beobachten, die durch ihren Schlag erzeugt wird.

Zeichnen Sie die Zilien mit Hilfe einer kontrastreichen DIC-Bildgebung auf, um ihre Schwebungsfrequenz zu quantifizieren.

Um die Schnitte abzubilden, legen Sie die Gehirnschnitte in 30-Millimeter-Glasbodenkulturschalen mit 1 Milliliter hochglukosereichem Medium und stellen Sie die Umgebung der geschlossenen Mikroskopkammer mit einer 60-fachen Ölimmersionslinse auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid ein.

Fokussieren Sie sich dann auf die Zellen mit regulärem DIC-Durchlicht. Dann, der Richtung der DMEM-Blasenbewegung folgend, als Anhaltspunkt für die Position der beweglichen ependymalen Zilien, verwenden Sie den DIC-Filter, um einen Bereich auszuwählen, der gesunde Zellen mit beweglichen Zilien im lateralen Ventrikel des Gehirns enthält. Nach der Identifizierung der ependymalen Zilien passen Sie das Licht und die Fokussierung an, um ein zufriedenstellendes Bild zu erhalten.

Legen Sie als Nächstes die Live-Imaging-Parameter in der Imaging-Software fest. Hier werden beispielsweise 24-Bit-Bilder aufgenommen, wobei das Kamera-Binning auf 1 mal 1 eingestellt ist, kombiniert mit dem 60-fachen Objektiv und einer Belichtungszeit von 5 bis 10 Millisekunden.

Öffnen Sie die Mikroskopblende auf das optimale Niveau für eine minimale Belichtungszeit und nehmen Sie die DIC-Bilder auf. Beobachten Sie, wie die Live-Bilder an die Kamera übertragen werden, um eine schnelle und sofortige Bildaufnahme ohne Verzögerung zu ermöglichen. Die Geschwindigkeit des Zilienschlagens kann dann auf der Grundlage der Anforderung der minimalen Belichtungszeiten berechnet werden, um einen ausreichenden Bildkontrast zu erhalten.