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Nehmen Sie einen getrimmten, in Harz eingebetteten Gewebeschnitt aus dem Maushirn, der den Hippocampus enthält.
Der Schnitt wird mit Schwermetallen gefärbt, um den Kontrast unter einem Elektronenmikroskop zu verbessern.
Montieren Sie den Abschnitt mit Cyanacrylatkleber auf einen Aluminiumstift.
Beschichten Sie die Blockseiten mit kolloidaler Silberpaste, um einen leitenden Weg zum Aluminiumstift zu schaffen.
Untersuchen Sie den Gewebeblock mit einem seriellen Blockflächen-Rasterelektronenmikroskop (SBFSEM).
Innerhalb des SBFSEM schneidet das Ultramikrotom den Block nacheinander in ultradünne Schichten, während ein Niederspannungs-Elektronenstrahl die freiliegende Oberfläche abtastet.
Ein Rückstreuelektronendetektor nimmt hochauflösende 2D-Bilder auf, die Mitochondrien und umgebende zelluläre Strukturen sichtbar machen.
Passen Sie mit geeigneter Software die Helligkeit und den Kontrast an, um die Bildschärfe zu verbessern.
Richten Sie die sequenziellen Bilder aus, um ein 3D-Volumen des Hirngewebes zu rekonstruieren. Diese 3D-Rekonstruktion ermöglicht eine präzise Kartierung der mitochondrialen Morphologie, der räumlichen Verteilung und ihrer Beziehungen innerhalb der neuronalen Kompartimente.
Schneiden Sie die Proben auf den interessierenden Bereich zu und befestigen Sie sie mit gelierendem Cyanacrylat-Sekundenkleber auf einem Aluminiumstift. Beschichten Sie dann die Probe mit kolloidaler Silberpaste an den Seiten des Blocks, um einen leitenden Weg zum Aluminiumstift zu schaffen. Untersuchen Sie die Gewebeproben mit einem Rasterelektronenmikroskopsystem, das mit einem Ultramikrotomtisch in der Kammer und einem Rückstreuelektronendetektor mit niedrigem Kilovolt ausgestattet ist.
Bilden Sie die Proben mit diesen Einstellungen ab. Beginnen Sie die Analyse, indem Sie den Bildtyp und dann den 8-Bit-Modus auswählen, um die Bilder vom ursprünglichen proprietären 16-Bit-Format in das 8-Bit-TIFF-Format zu konvertieren. Wenn die automatische Kontrast- und/oder Helligkeitskonvertierung während dieses Schritts für Bilder nicht ideal ist, öffnen Sie die 16-Bit-Bilder erneut und drücken Sie auf Bild. Passen Sie den Helligkeitskontrast an.
Wählen Sie einen Bereich aus, der für alle Bilder geeignet ist, und drücken Sie auf Übernehmen. Führen Sie dann die Konvertierung durch. Wenn es zu inakzeptablen Bildbewegungen zwischen den Slices gekommen ist, richten Sie die Bildstapel aus, indem Sie Plug-Ins, Registrierung und lineare Stapelausrichtung mit SIFT auswählen und die Ausrichtung für den Nur-Translationsmodus und nicht für den Starrkörper festlegen.
Vergrößern Sie die Leinwandgröße vor der Registrierung, indem Sie Bild Leinwandgröße anpassen auswählen. Alternativ können Sie das Bild auf einen interessanten Bereich reduzieren, indem Sie den gewünschten Bereich auswählen und dann zuschneiden. Skalieren Sie bei Bedarf Bilder mit image j auf eine kleinere, besser handhabbare Größe und wählen Sie dann image und scale aus.