Fluoreszenz-Photoaktivierungsbildgebung des Neurofilamenttransports in myelinisierten Mausaxonen

Beginnen Sie mit einer Perfusionsanordnung, die auf dem Tisch eines inversen Mikroskops platziert wird.

Die Perfusionsanordnung enthält einen präparierten peripheren Nerv, der zwischen einem Deckglas und einem Mikroaquädukt-Objektträger mit kontinuierlicher Kochsalzperfusion gesichert ist.

Die myelinisierten Axone des Nervs exprimieren die grünen, mit Fluorophoren markierten Neurofilamente.

Fokussieren Sie sich mit Hellfeldbeleuchtung auf die myelinisierten Axone.

Wechseln Sie in den konfokalen Modus, bleichen Sie mit hoher Laserleistung und nehmen Sie dann ein Referenzbild mit geringer Autofluoreszenz und geringer Laserleistung auf.

Zeichnen Sie parallele Linien entlang des Axons, um die Länge des Photoaktivierungsfensters zu definieren. Verwenden Sie dies als Richtlinie, um einen rechteckigen Aktivierungsbereich zu erstellen.

Beleuchten Sie diesen Bereich mit einer bestimmten Wellenlänge, um die mit grünen Fluorophoren markierten Neurofilamente zu aktivieren und sie zum Fluoreszieren zu bringen. Erfassen Sie das Bild.

Nehmen Sie nach der Aktivierung Zeitrafferbilder auf.

Im Laufe der Zeit bewegen sich die fluoreszierenden Neurofilamente in beide Richtungen und breiten sich in benachbarte flankierende Regionen aus.

Das Auftreten von Fluoreszenz in den flankierenden Regionen, die an die Aktivierungsregion angrenzen, bestätigt den Transport von Neurofilamenten.

Fassen Sie das proximale Ende des Nervs und legen Sie es langsam auf ein Decktuch. Richten Sie es dann unter sanfter Spannung auf. Platzieren Sie den Mikroaquäduktschieber mit dem gerillten Schieber nach unten über den Nerv und positionieren Sie die Strömungsrichtung parallel zum Nerv. Drehen Sie den Deckglas und die Mikro-Aquädukt-Baugruppe um und platzieren Sie sie in das Gehäuse der Perfusionskammer, wobei der Schieber der äußeren Dichtung gegenüberliegt.

Um die Perfusionskammer zu sichern, setzen Sie sie in das Metallgehäuse ein und drehen Sie den Sicherungsring. Drücken Sie den Kolben der Kochsalzspritze langsam herunter und füllen Sie die Perfusionskammer. Halten Sie den Einlass- und Auslassschlauch, den Auslasskolben und die Spritze während der Einrichtung und Bildgebung immer über der Kammer selbst hoch. Übertragen Sie die Perfusionsanordnung auf einen inversen Mikroskoptisch und montieren Sie die Kochsalzspritze in die Spritzenpumpe. Starten Sie dann den Motor und stellen Sie die Drehzahl auf eine Durchflussmenge von 0,25 Millilitern pro Minute ein.

Schließen Sie die Inline-Lösungsheizung an und stellen Sie sie auf 37 Grad Celsius ein. Schließen Sie die Objektivheizung an und stellen Sie sie auf 37 Grad Celsius ein. Tragen Sie Öl auf das Objektiv auf und setzen Sie die Perfusionskammer in die Tischhalterung ein. Tragen Sie Öl auf das Heizkissen der Kammer auf und befestigen Sie es an der Perfusionskammer. Schließen Sie es dann an und stellen Sie es auf 37 Grad Celsius ein.

Verriegeln Sie die Perfusionskammer mit dem Tischadapter und bringen Sie das Objektivöl mit dem Deckglas an der Unterseite der Kammer in Kontakt. Verwenden Sie Hellfeldbeleuchtung, um auf die Axonschicht auf der Unterseite des Nervs zu fokussieren, die der Deckglasoberfläche am nächsten liegt. Myelinisierte Axone sind an einer Myelinscheide zu erkennen, die unter Hellfeld-Durchlichtbeleuchtung ohne Kontrastverstärkung sichtbar ist.

Nehmen Sie ein Hellfeld-Referenzbild auf, das die Richtungsabhängigkeit des Nervs aufzeichnet. Nehmen Sie dann ein konfokales Bild mit einem 488-Nanometer-Laser und einem Emissionsfilter auf, der für photoaktivierbares GFP geeignet ist. Stellen Sie die Laserleistung auf das Fünffache der normalen Bildleistung ein und nehmen Sie ein Bild mit einer Belichtungszeit von drei bis vier Minuten auf. Nehmen Sie dann ein weiteres konfokales Bild auf, um die Autofluoreszenz vor der Aktivierung nach dem Bleichschritt aufzuzeichnen.

Zeichnen Sie eine Linie parallel zu den Axonen mit einer Länge, die der gewünschten Größe des Aktivierungsfensters des Hellfeldbildes entspricht. Zeichnen Sie mit dieser Linie als Richtlinie einen rechteckigen Interessenbereich quer über das Sichtfeld, der senkrecht zu den Axonen verläuft. Aktivieren Sie die GFP-Fluoreszenz in diesem Bereich durch Musteranregung mit dem 405-Nanometer-Licht, wobei Sie sicherstellen, dass kurz vor und unmittelbar nach der Aktivierung ein Bild aufgenommen wird. Wenn die Aktivierung abgeschlossen ist, starten Sie einen einminütigen Timer. Wenn sie erlischt, starten Sie die Aufnahme einer Zeitrafferserie.