Biolumineszenz-Bildgebung zur Untersuchung von Kalziumtransienten in Drosophila-Gehirnstrukturen

Befestigen Sie eine immobilisierte transgene Drosophila mit ihrem Kopf in einer Aufnahmekammer auf einem Fluoreszenzmikroskoptisch.

Der Pilzkörper der Fliege besteht aus Neuronen, die das kalziumempfindliche biolumineszierende Fusionsprotein exprimieren, das durch einen vorgeladenen Cofaktor aktiviert wird.

Schließen Sie einen Perfusionsschlauch an die Kammer an. Lokalisiere die fluoreszierenden Pilzkörper und konzentriere dich dabei auf den Kelch und die medialen Lappen. Bestätigen Sie die Drainage mit einem Puffer.

Stellen Sie die Bildgebungsparameter ein und fokussieren Sie sich auf den Kelch- und Mediallappen. Nehmen Sie im Dunkeln Basis-Fluoreszenzbilder der Pilzkörper auf, bevor Sie dem Stimulanzien ausgesetzt werden.

Perfundieren Sie Nikotin in einem kalziumhaltigen Puffer, um nikotinische Acetylcholinrezeptoren zu aktivieren, wodurch der Kalziumeinstrom und die biolumineszierende Lichtemission ausgelöst werden.

Mit Puffer waschen, um die Ausgangsbedingungen wiederherzustellen.

Kaliumchlorid perfundieren, um Neuronen zu depolarisieren, wodurch die intrazelluläre Kalziumfreisetzung und die biolumineszierende Signalemission ausgelöst werden.

Mit Puffer waschen, um die Ausgangsbedingungen wiederherzustellen.

Bilder analysieren, um die räumliche und zeitliche Kalziumaktivität im Kelch und im Medialappen zu beurteilen.

- Legen Sie anschließend die Probe auf die Halterung unter dem Mikroskop und stellen Sie die Vergrößerung auf 5x ein. Führen Sie dann den Perfusionsschlauch durch die Punktion in den Kanal ein. Stellen Sie das Mikroskop auf den Fluoreszenzmodus ein, zentrieren Sie es und stellen Sie die Pilzkörper in den Fokus. Sobald die Pilzkörper scharf sind, ändere die Vergrößerung auf 20x. Zentrieren Sie das Bild neu und passen Sie den Fokus an.

Positionieren Sie als nächstes das Entwässerungsgerät über dem Entwässerungsbecken und stellen Sie die Höhe des Entwässerungsshunts so ein, dass sich die Spitze direkt über dem Entwässerungsbecken befindet. Spülen Sie dann die Probe 30 Sekunden lang mit Ringer-Lösung, um eine ausreichende Drainage zu überprüfen. Ziehen Sie abschließend die Abschirmung herunter, um das Gerät gegen äußeres Licht abzudichten.

Nehmen Sie mit dem automatisierten System des Photon Imager-Programms Feineinstellungen am Fokus vor und nehmen Sie ein Referenzfluoreszenzbild der Pilzkörper auf. Passen Sie die Position der Felder für den Interessenbereich über dem Kelch, den Zellkörpern und den Mediallappen an, indem Sie auf die Felder klicken und sie bei gedrückter Ctrl-Taste in die Position ziehen.

Zeichnen Sie nun die Ausgangswerte etwa 5 bis 10 Minuten lang auf. Legen Sie anschließend den Schalter um, um den Nikotinfluss zu starten. Drücken Sie gleichzeitig die Eingabetaste und fügen Sie eine Notiz hinzu, um anzuzeigen, dass der Nikotinfluss begonnen hat. Stoppen Sie nach einer Minute den Fluss, und machen Sie einen weiteren Vermerk im Protokoll, der angibt, dass der Fluss gestoppt wurde. Waschen Sie dann die Probe fünf Minuten lang mit der Ringer-Lösung.

Während sich die Probe erholt, schalten Sie die Wäsche aus, stellen Sie den Timer auf weitere fünf Minuten ein und bereiten Sie sich darauf vor, den Kaliumchloridfluss zu starten. Wenn Sie bereit sind zu beginnen, starten Sie den Kaliumchloridfluss und geben Sie 100 millimolare Kaliumchlorid-Anfänge in das Probenprotokoll ein. Nach einer Minute stoppen Sie den Durchfluss und geben Sie Kaliumchlorid abgeschaltet in das Probenprotokoll ein. Waschen Sie dann die Probe eine Minute lang mit Ringer-Lösung und schalten Sie das Mikroskop in den Fluoreszenzmodus. Nehmen Sie ein letztes Fluoreszenzbild auf, schalten Sie dann die Ringer-Lösung aus und entfernen Sie die Probe.