Gezielte neuronale Ablation mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie in einer Zebrafisch-Larve

Beginnen Sie mit einer betäubten transgenen Zebrafischlarve, die in Agarose immobilisiert und in eine Petrischale mit einer Anästhesielösung gelegt wird.

Positionieren Sie es unter einem Zwei-Photonen-Lasermikroskop, das zwei Photonen für eine detaillierte Bildgebung verwendet.

Konzentrieren Sie sich auf die oberen und unteren Schichten des Gehirns, um Grenzen für die Bildgebung festzulegen.

Nehmen Sie Bilder in verschiedenen Tiefen auf, um Neuronen vor der Laserbehandlung zu beobachten.

Passen Sie den Fokus auf den interessierenden Bereich an, und passen Sie die Rahmengröße an, um den Fokus auf Neuronen zu verfeinern.

Selektieren und bestrahlen Sie die Neuronen mit dem Zwei-Photonen-Laser.

Der Laser induziert lokalisierte Wärme, was zum neuronalen Tod mit minimaler Schädigung des umgebenden Gewebes führt. Nehmen Sie das Bild auf.

Vergleichen Sie Bilder vor und nach der Behandlung, um Fluoreszenzänderungen zu beurteilen.

Fokussieren Sie Neuronen in tieferen Ebenen neu und wiederholen Sie die Bestrahlung, um alle Neuronen in der interessierenden Region zu behandeln.

Nehmen Sie das Bild erneut auf und vergleichen Sie es mit dem Bild vor der Behandlung. Der Verlust der Fluoreszenz nach der Laserbehandlung bestätigt den Erfolg der neuronalen Ablation.

Legen Sie die in Agarose eingebettete Larve unter ein 2-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop und starten Sie das Mikroskopiesystem. Öffnen Sie die Bilderfassungssoftware und klicken Sie auf der Registerkarte Laser auf die Schaltfläche Ein, um den Laser einzuschalten. Warten Sie, bis sich der Status des Lasers von "Beschäftigt" in "Modus gesperrt" ändert.

Legen Sie auf der Registerkarte Kanäle die Wellenlänge des Lasers auf 880 Nanometer für die EGFP-Ablation oder 800 Nanometer für die GcAMP-Ablation fest. Wählen Sie das 20-fach-Objektiv aus, indem Sie den Objektivrevolver manuell bewegen. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Suchen. Klicken Sie auf GFP, um die Strahlengänge zu ändern und die Fluoreszenz direkt mit dem Auge zu betrachten. Zentrieren Sie das Gehirn der Zebrafischlarve im Gesichtsfeld. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Erfassung, um zur Zwei-Photonen-Mikroskopie zurückzukehren und die Laserleistung und -verstärkung einzustellen.

Um die Bedingung vor der Ablation aufzuzeichnen, klicken Sie auf Z-Stack, um die Option Z-Stack auszuwählen. Nachdem Sie sich auf das ventrale Ende des Larvengehirns konzentriert haben, klicken Sie auf die Schaltfläche Erste setzen, um die untere Grenze festzulegen. Nachdem Sie sich auf die dorsale Oberfläche des Gehirns konzentriert haben, klicken Sie auf die Schaltfläche Letzte einstellen, um die Obergrenze festzulegen. Klicken Sie abschließend auf die Schaltfläche Experiment starten, um die Z-Stack-Bildaufnahme auszuführen.

Wählen Sie als Nächstes das 63-fach-Objektiv aus, indem Sie den Objektivrevolver manuell bewegen. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Lokalisieren, um zur Epifluoreszenzmikroskopie zu wechseln. Zentrieren Sie die Zellen, die mit dem Auge abgetragen werden sollen. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Erfassung, um zur Laserscanning-Mikroskopie zurückzukehren.

Legen Sie auf der Registerkarte "Aufnahmemodus" die Framegröße auf 256 x 256 fest. Klicken Sie auf Live und beobachten Sie die interessierenden Neuronen. Suchen Sie dann, beginnend von der dorsalsten Seite, eine Fokusebene, in der die zu abtragenden Zellen fokussiert sind. Markieren Sie mit der Funktion "Regionen" auf jedem Neuron einen kleinen kreisförmigen Bereich mit einem Durchmesser von etwa einem Drittel der Zellgröße als ROI.

Stellen Sie die Scangeschwindigkeit auf 13,93 Sekunden pro 256 x 256 Pixel ein, was einer Laserverweilzeit von ca. 200 Mikrosekunden pro Pixel oder 200 Mikrosekunden pro halbem Mikrometer entspricht. Stellen Sie außerdem den Iterationszyklus auf 4 Wiederholungen ein. Klicken Sie auf Experiment starten, um die Zeitreihen- und Bleaching-Funktionen auszuführen. Vergleichen Sie das Bild vor der Ablation mit dem Bild nach der Ablation im Zeitreihenzyklus, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz in den Zielzellen verschwunden ist.

Verschieben Sie als Nächstes die Fokusebene etwas tiefer, und wählen Sie die nächste Fokusebene aus, in der unablierte Zellen angezeigt werden. Führen Sie die Bleichfunktion wie gerade gezeigt durch und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Zellen in der interessierenden neuronalen Struktur abgetragen wurden. Überprüfen Sie nach der Ablation die Zellen auf aufgehobene Fluoreszenz und wiederholen Sie die Laserbestrahlung gegebenenfalls.