JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 1:56 Min. • June 17th, 2025
Nehmen Sie eine polymerbeschichtete Multi-Well-Platte, die embryonale primäre Großhirnrindenzellen der Maus enthält, wie z. B. Vorläuferzellen und neuronale Zellen. Vorläuferzellen werden transfiziert, um fluoreszierende Proteine für die Markierung und Verfolgung zu exprimieren.
Bringen Sie die Platte in die vorgeheizte Inkubationskammer eines inversen Fluoreszenzmikroskops, um eine stabile Bildgebungsumgebung zu erhalten.
Lokalisieren Sie die Referenzposition auf der Platte, um konsistente Bildgebungspositionen zu erhalten.
Wählen Sie mehrere Bildgebungsfelder pro Vertiefung bei höherer Vergrößerung aus, um die Wahrscheinlichkeit zu maximieren, transfizierte Zellen zu beobachten.
In regelmäßigen Abständen können Sie gleichzeitig Phasenkontrastbilder aufnehmen, um die Zellmorphologie und -dynamik aufzudecken, und Fluoreszenzbilder, um die Expression fluoreszierender Proteine zu überwachen.
Vergleichen Sie Zeitraffer-, Phasenkontrast- und Fluoreszenzbilder, um die Teilung und Differenzierung von Vorläuferzellen in neuronale Linien zu verfolgen.
Um Retrovirus-transduzierte Zellen abzubilden, legen Sie die Gewebekulturplatte in eine Bildgebungskammer, die mit Temperatur- und Kohlendioxidreglern verbunden ist, um die Zellen unter konstanten Bedingungen von 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid zu halten.
Wählen Sie eine Position in der XY-Achse, die als Nullpunkt dienen soll, und kalibrieren Sie den Nullpunkt. Wählen Sie 10 bis 15 Positionen pro Vertiefung aus, die mit 10-facher Vergrößerung abgebildet werden sollen. Stellen Sie die Software so ein, dass Phasenkontrastbilder alle fünf Minuten und Fluoreszenzbilder alle drei Stunden aufgenommen werden, um die Phototoxizität zu verringern. Überprüfen und justieren Sie den Fokus in den ersten drei Stunden des Experiments, da er sich ändern kann, während sich die Temperatur ausgleicht.