JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 3:18 Min. • June 17th, 2025
Nehmen Sie primäre kortikale Neuronen von Nagetieren, die auf einer beschichteten Glasbodenschale mit Medium kultiviert wurden.
Diese Zellen exprimieren ein genetisch kodiertes ALS-assoziiertes Protein und einen Kalzium-Biosensor.
Ersetzen Sie das Medium durch einen kaliumarmen Chloridpuffer.
Inkubieren, um die neuronale Aktivität im Ruhezustand und den Kalziumspiegel zu erhalten.
Montieren Sie die Schüssel auf einem konfokalen Mikroskoptisch und positionieren Sie den Perfusionsschlauch.
Fokussieren Sie sich mit Hellfeldbeleuchtung auf die Neuronen und wechseln Sie dann zur Fluoreszenzbildgebung.
Stimulieren Sie den Biosensor mit dem Laser des Mikroskops und zeichnen Sie die Fluoreszenzemission auf, um den intrazellulären Kalziumspiegel zu bestimmen.
Als nächstes durchtränken Sie die Schale mit Puffer mit hohem Kaliumchloridgehalt.
Die hohe Kaliumkonzentration depolarisiert die Neuronen und öffnet spannungsgesteuerte Kalziumkanäle an den präsynaptischen Enden. Dies ermöglicht den Kalziumeinstrom, der die neuronale synaptische Aktivität initiiert.
Das erhöhte intrazelluläre Kalzium bindet an den Biosensor und bewirkt eine Konformationsänderung, die die Fluoreszenz verstärkt.
Setzen Sie die Au
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