JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 3:06 Min. • June 17th, 2025
Beginnen Sie mit anästhesierten transgenen Zebrafischlarven in einer Auffangkammer mit einem sauerstoffhaltigen physiologischen Puffer unter einem Stereomikroskop.
Das Kleinhirn im Gehirn enthält genetisch veränderte Purkinje-Neuronen, die fluoreszierende zytoplasmatische Proteine exprimieren.
Entfernen Sie überschüssiges Medium und fügen Sie dann geschmolzene Agarose hinzu, um die Larven für eine stabile Bildgebung zu immobilisieren.
Richten Sie die Larven mit der Rückenseite nach oben aus, um das Kleinhirn sichtbar zu machen.
Nach dem Erstarren überschüssige Agarose abschneiden. Schneiden Sie mit einer Glasnadel die pigmentierte Haut über dem Gehirn heraus, um sie freizulegen.
Drehen Sie den Agaroseblock auf eine Bildgebungskammer mit geschmolzener Agarose, um ihn unter einem inversen Mikroskop abzubilden.
Fügen Sie den physiologischen Puffer hinzu, um die neuronale Funktion zu erhalten.
Positionieren Sie die Kammer unter einem inversen Konfokalmikroskop. Wenden Sie Anregungslicht an, um die fluoreszierenden Proteine anzuregen und so die markierten Neuronen sichtbar zu machen.
Wenn die pigmentierten Hautzellen nicht entfernt werden, streuen und absorbieren sie das Anregungslicht, wodurch die Fluoreszenzintensität verringert wird.
Die Hautentfernung verbessert die Lichtdurchdringung, um die Fluoreszenzintensität zu erhöhen und die Visualisierung von Neuronen zu erleichtern.
Um die Larve einzubetten, verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, um die anästhesierte Larve in eine Montagekammer unter einem Stereomikroskop zu bringen. Wenn sich eine Larve noch bewegen kann, verwenden Sie den Fisch nicht für den Versuch, bis die Fische völlig bewegungsunfähig sind. Wenn die Larven unbeweglich sind, entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Medium und geben Sie sofort mindestens 1 Milliliter niedrigschmelzende Agarose auf die Larve.
Richten Sie den Zebrafisch mit der Rückenregion nach oben so nah wie möglich an der Oberfläche der Agarose aus. Wenn die Larven mit einem inversen Mikroskop abgebildet werden, schneiden Sie nach dem Erstarren die Agarose, die die Larve enthält, in einen kleinen quaderförmigen Block ab. Um das Gehirn für die Bildgebung freizulegen, schneiden Sie bei Bedarf die überschüssige Agarose über der interessierenden Hirnregion ab und verwenden Sie eine Glasnadel, um einen kleinen Schnitt durch die Haut in der Nähe, aber nicht über der interessierenden Region zu machen, ohne zu tief in das Gewebe einzudringen.
Bewegen Sie die Nadel kaum direkt unter der Hautoberfläche und machen Sie vorsichtig sehr kleine Schnitte um den interessierenden Bereich, bis die Haut über dem interessierenden Bereich entfernt oder beiseite geschoben werden kann. Wenn das Gewebe von allen Embryonen entfernt wurde, geben Sie einen kleinen Tropfen niedrigschmelzende Agarose in eine zuvor vorbereitete Bildgebungskammer eines inversen Mikroskops und drehen Sie den quaderförmigen Agaroseblock mit einem kleinen Spatel um 180 Grad auf den Agarosetropfen in der Bildgebungskammer. Wenn die Agarose erstarrt ist, füllen Sie die Bildgebungskammer mit frischem ACSF und beginnen Sie mit der Bildgebung der Larve.