Name: Multiparametrische Optical Mapping der Langendorff-perfundierten Rabbit Heart (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Erfahren Sie die multiparametrische Optical Mapping-Methode zur Untersuchung kardialer Elektrophysiologie, Erregungsleitung und Kalziumhandling am Langendorff-perfundierten Kaninchenherzen.

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1. Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie frisch zubereitete Tyrodes "-Lösung (in mM, 128.2 NaCl, 1,3 CaCl 2, 4,7 KCl, 1,19 NaH 2 PO 4, 1,05 MgCl 2, 20,0 NaHCO 3, und 11,1 Glucose). Zur Beschleunigung der täglichen Zubereitung von Lösungen, bereiten zwei Stammlösungen im Voraus und speichern Sie sie bei +4 ° C Kühlschrank: (1) Lager I (in g/2L, 374,6 NaCl, 9,56 CaCl 2, 17,52 KCl, 8.21 NaH 2 PO 4 , 10,67 MgCl 2) und (2) Lager II (in g/2L, 84,01 NaHCO 3). Um 2L von Tyrodes "-Lösung genügt für einen Versuch nehmen 1840mL VE-Wasser und mischen in das 80 ml Lager I, 80ml von Lager II und 4g Glukose. </li><li> Stammlösungen von Farbstoffen und Entkoppler: (1) Erregung und Kontraktion Entkoppler blebbistatin Stammlösung (Tocris Bioscience, 2mg/mL Lösung in DMSO), (2) Spannung Farbstoff di-4-ANEPPS Stammlösung (Invitrogen, 1mg/ml Lösung in DMSO), (3) Spannung Farbstoff RH 237-Stammlösung (Invitrogen, 1.25mg/ml Lösung in DMSO), (4) Calcium-Indikator Rhod-2AM Stammlösung (Invitrogen, 1mg/ml Lösung in DMSO). Ein einzelnes Kaninchen Experiment erfordert etwa 30 ul der di-4-ANEPPS Stammlösung, 30 ul des RH237 Stammlösung und 200 ul der Rhod-2AM Stammlösung. Um zu vermeiden, wiederholtes Einfrieren und Auftauen, speichern wir 100 ul Aliquots von di-4-ANEPPS bei -20 ° C. Andere Farbstoffe sind auch bei -20 ° C gelagert Bewahren Sie die gelösten blebbistatin in +4 ° C Kühlschrank. </li><li> Vor der Ernte das Herz, Transfer Tyrodes "-Lösung in die 2L Flasche und legen Sie sie in ein Wasserbad (Fisher Scientific), die die Temperatur der Lösung hält bei 37 ° C. 5% CO 2 - Die Lösung wird mit 95% O 2 mit Sauerstoff versorgt. Der pH-Wert ist um 7.35 gepflegt ± 0,05 durch Anpassung der Sauerstoffversorgung Ebene. Die Lösung ist in der Langendorff Perfusion System zirkuliert und wird durch ein Nylonnetz (Porengröße: 11μm, Millipore) gefiltert in die Perfusion Zeile vor der Kanüle gelegt. </li><li> Bereiten Überwachungsgeräte vor der Ernte das Herz. Ein Druckwandler (WPI) wird verwendet, um den Aortendruck während des Experiments zu überwachen. Baseline der Druckaufnehmer wird angepasst, um mmHg Null, wenn das Herz nicht auf die Perfusion System angeschlossen. Pseudo-EKG-Elektroden sind in der Kammer zur Angleichung Ableitung I, II und III der Einthoven Dreieck EKG gestellt. </li></ol> 2. Ernte und Perfusion des Kaninchenherzen <ol><li> Fix das Kaninchen in das Kaninchen restrainer. Euthanize das Kaninchen durch eine intravenöse Injektion von Natrium-Pentobarbital (50 mg / kg) mit 2000 U Heparin. Wenn das Kaninchen völlig eingeschläfert, die durch die Abwesenheit von Schmerz-Reflex bestimmt wird, ist der Brusthöhle schnell geöffnet und das Herz und die Lunge herausgeschnitten. </li><li> Machen Sie einen Schnitt am oberen Ende der aufsteigenden Aorta, bevor alle Zweige des Aortenbogens. Spülen Sie die Luft aus der aufsteigenden Aorta und dann schnell kanülieren das Herz einer 16-Gauge Kanüle, die zuvor zu einer Blase Trapper, die sehr wichtig für die Reinhaltung von Luft aus der Koronarien verbunden ist. Sobald das Herz retrograd in einem nicht-rezirkulierenden Langendorff Perfusion System perfundiert, um einen Schnitt zu den Herzbeutel schnell zu öffnen. </li><li> Entfernen Sie die Lungen-, Luftröhren-, Fett-und Bindegewebe, während das Blut durch die Perfusion gespült. </li><li> Sehr wichtig! Ein Silikon-Schlauch (~ 3cm lang und 2 mm Durchmesser) wird durch eine Lungenvene und Mitralklappe in den linken Ventrikel (LV) eingefügt und dort während des Experiments. Dieses Rohr gibt die Lösung, die in der LV gefangen ist. Ohne Umlauf Stunden während der Langedorff-Perfusion Experiment in einer mechanisch immobilisiert Herz, ist es wahrscheinlich zu schweren Ischämie in der LV Hohlraum führen und Herzrhythmusstörungen zu produzieren. </li><li> Bewegen Sie das Herz mit der Kanüle der Rückführung Langendorff-Perfusion mit der optischen Abbildung Apparat. </li></ol> 3. Experimente mit dem Panoramic Optical Mapping System <ol><li> Legen Sie das Herz in eine maßgeschneiderte Sechseck Kammer und verbinden Sie die Kanüle auf die Perfusion System. Pflegen Sie die Aortendruck bei 60 ± 5 mmHg durch Anpassung der Strömungsgeschwindigkeit des Perfusionspumpe. Monitor führen I pseudo-EKG. Pflegen Sie die pH-Wert bei etwa 7,35 ± 0,05. </li><li> Schalten Sie das Licht ausgesetzt, weil blebbistatin durch UV-und Low-End-(450-490 nm) 17 von den sichtbaren Teil des Spektrums photoinactivated ist. Langsam injizieren blebbistatin Stammlösung durch den Ansaugstutzen in die Luftblase Trapper über die Kanüle entfernt. Langsam injizieren 0.1ml blebbistatin für jeden Bolus-Injektion. Warten Sie, bis der Druck zu stabilisieren, bevor die nächste Injektion. </li><li> Gently Ort der Stimulation Elektrode auf die Lage speziell auf Ihre experimentelles Design. </li><li> Stellen Sie das Bild des Herzens in das Milchglas in der Bildebene von jedem Foto-Dioden-Array (PDA) befindet sich aus dreigleichmäßig verteilte Winkel um das Herz. Passen Sie die Position der Kanüle und die Abstände zwischen den einzelnen PDA und das Herz, um das Herz in die field-of-view aller drei PDAs fit. Machen Sie ein Foto jedes fokussiertes Bild in das Milchglas. </li><li> Langsam injizieren 10 ~ 20 &amp;mgr; l di-4-ANEPPS Stammlösung durch den Ansaugstutzen in der Luft-Blasenfalle in der Perfusionslösung. Warten Sie 1 ~ 3 Minuten vor der Einnahme von optischen Aufnahmen. </li><li> Für die erste Aufnahme, drehen Sie die grüne LED (keine Anregungsfilter, LED FLOOD, LUMILEDS) auf, nehmen optische Aufnahmen gleichzeitig von drei PDAs mit dem Custom-made-Datenerfassungssystem angeschlossen, 5 und schalten Sie das LED-Licht. Prüfen Sie die Qualität der Signale von verschiedenen Pixel alle drei PDAs. Add 0,1 ~ 0,2 ml blebbistatin Stammlösung wenn Bewegungsartefakte in der optischen Wirkung Potential bemerkt werden. Weitere 5 ul di-4-ANEPPS Stammlösung, wenn das Signal-Rausch-Verhältnis ist gering. </li><li> Beenden Sie die entworfen experimentelle Protokoll für die funktionelle Studie. Re-Fleck das Herz mit zusätzlichen 5μL di-4-ANEPPS Stammlösung, wenn das Signal verschlechtert während der Experimente durch Ausbleichen oder Auswaschen. </li><li> Schalten Sie die Raumbeleuchtung nach Abschluss der funktionellen Studie. Nehmen Sie Bilder des Herzens aus 36 gleichmäßig verteilten Winkeln. Dies wird durch Drehen des Herzens bei einem Schritt von 10 ° mit einer digitalen Kamera auf den Speicherort einer PDA feste erreicht. </li><li> Nehmen Sie das Herz aus der Kammer. Lassen Sie alle Lösungen. Waschen Sie die Perfusion System in der Reihenfolge der DI-Wasser, 70% Reagenz Alkohol, und wieder DI-Wasser. </li><li> Die Datenanalyse umfasst die Rekonstruktion des Herzens Geometrie aus den 36 digitalen Fotos, die Registrierung der das optische Signal auf der Oberfläche der rekonstruierten Geometrie und Quantifizierung der Dauer des Aktionspotentials (APD), Leitgeschwindigkeit (CV), Phase, etc. 6 </li></ol> 4. Experimente mit dem Dual-Mapping System <ol><li> (Weiter nach Teil 2) Platzieren Sie den kanülierten Herzen in ein Glas Kammer (Radnoti) und verbinden Sie die Kanüle auf die Perfusion System. Pin unten das Herz an das Silizium Boden der Kammer an der Herzspitze und Atrien. </li><li> Schalten Sie das Licht ausgesetzt wird. Langsam injizieren blebbistatin Stammlösung (15 ~ 20 min bis 10 um zu erreichen) durch den Ansaugstutzen vor Perfusionskanüle zum Herzen zu immobilisieren. </li><li> Legen Sie eine Kunststoff-Petrischale oder andere Glasscheibe abdecken, oberhalb der epikardialen Oberfläche, um die Bewegung der Lösung Oberfläche zu reduzieren. </li><li> Focus zwei CMOS-Kameras im dualen System zur Kartierung (Ultima-L, SciMedia) zur gleichen Sichtfeld. Emittierte Fluoreszenz wird von einem dichroitischen Spiegel (635 nm-Cutoff, Omega Optical) getrennt und gefiltert durch eine 700nm Langpassfilter (Thorlabs) für Spannungssignale und ein 590/30 nm Bandpassfilter (Omega Optical) für Calcium-Signale. </li><li> Richten Sie den Lichtleiter aus zwei Halogenlampen (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT; SciMedia, Costa Mesa, CA) in Richtung des Mapping-Bereich im Hinblick auf eine gleichmäßige Ausleuchtung zu erreichen. Anregung Filter (531/40 nm, Semrock) verwendet werden. </li><li> Stain das Herz mit der Spannung Farbstoff RH 237-Stammlösung (10 ~ 30 ul) durch den Ansaugstutzen. </li><li> Mix der Rhod-2AM (0,2 ml) Stammlösung mit Pluronic F-127 (Invitrogen, 1:1-Mischung). Ultraschallbad für 1 Minute in einem mit Wasser Ultraschallbad. Injizieren Sie die Mischung durch die Blase Trapper-Port. Warten Sie ca. 20 Minuten, damit die de-Veresterung der Rhod-2 AM, bevor Kartierung beginnt. </li><li> Für eine Aufnahme, schalten Sie die Pumpe an Superfusion Bewegung an der Oberfläche der Lösung zu vermeiden, schalten Sie den Anregungslichtquelle (die Halogenlampen), nehmen optische Aufnahmen mit beiden Kameras mit dem Datenerfassungssystem (Ultima-L, SciMedia) ; schalten Sie das Anregungslicht, und schalten Sie die Pumpe Superfusion. Prüfen Sie die Qualität der optischen Signale. Re-Fleck das Gewebe, wenn nötig. </li><li> Beenden Sie den Rest des entworfenen experimentellen Protokoll für eine Studie. </li><li> Schalten Sie die Raumbeleuchtung und ein Lichtbild des Herzens, die das Sichtfeld. Nehmen Sie das Herz aus der Kammer. Lassen Sie alle Lösungen. Waschen Sie die Perfusion System in der Reihenfolge der DI-Wasser, 70% Reagenz Alkohol (Fisher Scientific) und DI-Wasser. </li><li> Datenanalyse enthält Messungen der APD, CV-, Calcium-Transienten Dauer (CaTD), die Verzögerung zwischen AP Aufstrich und CAT steigen, die Anstiegszeit des Calcium-Transienten und die Zeitkonstante eines monoexponentielle fit of the Cat Verfall. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/3160/3160fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Repräsentative Ergebnisse einer Langendorff-perfundierten Kaninchen Experiment mit der Panorama-optischen System zur Kartierung. (A) Die vordere Ansicht des Kaninchens Herz und die rekonstruierte Kaninchen Herzen Geometrie in Form einer dreidimensionalen Mesh-grid Oberfläche. (B) Twickelte er epikardialen Oberfläche farblich von der Phase (aus der Phasenebene Analyse 18) unter Angabe der Wellenfront in rot während einer Episode von Tachyarrhythmie gezeigt. (C) Die optische Wirkung Potenzial Aufnahmen aus fünf Standorten rund um die Phase Singularität von 1-5 in Feld B (D) Acht Snapshots der Aktivierung Wellenfront (rote Farbe) Ausbreitung markiert während eines Zyklus von einer stabilen reentrant Arrhythmie. Die Wellenfront Kreise um eine Phase Singularität, die sichtbar an der vorderen Oberfläche des Herzens ist im Uhrzeigersinn. Die Farbe für Repolarisation (blau) eingestellt wird teilweise durchsichtig, so dass der hintere Wellenfront sichtbar ist (zB bei 80ms, 100ms, 120ms und). Ein Film dieser reentrant Arrhythmie ist in der ergänzenden Video 1 zur Verfügung gestellt. Die Methoden zur Geometrie Wiederaufbau-, Signal-Registrierung, die Berechnung der Phase Karte und Oberfläche Auspacken sind im Detail an anderer Stelle 6 beschrieben. <img src="/files/ftp_upload/3160/3160fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse aus einer Langendorff-perfundierten Kaninchen Herzen Experiment mit dem Dual-Mapping-System (gleichzeitige Abbildung von Aktionspotential und Kalzium transient). (A) Die vordere Fläche des Herzens mit der Mapping-Sichtfeld von schwarzen Punkten übersät. (B) A Nahaufnahme von Aufnahmen von einem Standort. (C) Sample Spuren Aktionspotential (blau) und Kalzium-Transienten (rot) aus einem Array von gleichmäßig verteilten Standorten durch die schwarzen Punkte in Panel A. Beachten Sie, dass nicht alle Pixel-Aufnahmen gezeigt werden und die räumliche Auflösung ist 200 um markiert.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Basierend auf unserer Erfahrung, sind der Schlüssel für eine erfolgreiche Langendorff-perfundierten Kaninchen Herzen Experiment gut vorbereitet Tyrodes &quot;-Lösung, schnelle Ernte des Herzens, gepflegte Perfusionsdruck und entsprechende pH-Wert der Lösung mit Sauerstoff in der Perfusion System. Um das Signal mit der höchstmöglichen Signal-Rausch-Verhältnis aufzunehmen, müssen wir Faktoren, einschließlich Lichtquelle, optische Filter, Fokussieroptik, Photodetektoren, etc 19 zu berücksichtigen. Einzelheiten zu diesen Aspekten werden an anderer Stelle 19 erläutert. Junge Kaninchen (Alter: 4-5 Monate, Gewicht: 7-9 kg) verwendet werden, um die epikardialen Fett, das das Signal-Rausch-Verhältnis sinkt der optischen Signale zu vermeiden. Das Signal von jedem Pixel aufgezeichnet wird eine gewichtete Integration des emittierten Lichts von einem Volumen von Gewebe. Die Tiefe dieser Gewebe ist abhängig von der Anregungs-und Emissionswellenlänge des Farbstoffes verwendet. Für di-4-ANEPPS, als Beispiel, ist der geschätzte Eindringtiefe 300 pm in der Kaninchen-Herz 20. So sollte Auslegung des optischen Signals mit Vorsicht erfolgen, wenn die lokale Heterogenität der elektrischen Funktion im Sinusknoten, AV-Knoten sind, und während der ventrikulären Arrhythmien 1,21,22. Eine Einschränkung der optischen Mapping-Technik mit Elektrode Aufnahme im Vergleich ist, dass die Repolarisationsphase der optischen Aktionspotential wird oft durch Bewegungsartefakte durch Herzkontraktion verursacht verzerrt. Mechanische Einschränkung verwendet werden, um das Artefakt zu reduzieren, kann aber nicht vollständig beseitigen. Im Vergleich dazu sind pharmakologische Erregung und Kontraktion Entkuppler wirksam bei der Beseitigung der Bewegungsartefakte. Allerdings konnten diese Entkoppler (z. B. 2,3-Butandion Monoxim) haben erhebliche elektrophysiologische Nebenwirkungen. Blebbistatin wurde gezeigt, dass keine unerwünschten Nebenwirkungen auf das Herz-Elektrophysiologie in der normalen Herzens 23 haben, und ist somit eine vielversprechende Entkoppler für optische Abbildung. Es wird darauf hingewiesen, dass die Beschleunigung von Ödemen infolge der Abschaffung der Kontraktion könnte auch Auswirkungen auf die Elektrophysiologie werden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S271-1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 (2H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> C79-500 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S217-500 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (6H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 (H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S369-500 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S233-3 </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> D16-1 </td></tr><tr><td> Blebbistatin </td><td> Tocris Bioscience, Ellisville, MO </td><td> 1760 </td></tr><tr><td> Di-4-ANEPPS </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> D1199 </td></tr><tr><td> RH237 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> S1109 </td></tr><tr><td> Rhod-2AM </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> R1244 </td></tr><tr><td> Pluronic F127 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> P3000MP </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid (DMSO) </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> D2650 </td></tr></tbody></table>

multiparametrische optical mapping der langendorff-perfundierten rabbit heart

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Die optische Bildgebung und fluoreszierende Sonden erheblich erweiterte Forschungsmethodik im Bereich der Elektrophysiologie des Herzens in einer Weise, die nicht durch andere Ansätze 1 erreicht worden konnte. Mit dem Einsatz des Calcium-und Spannungs-sensitiven Farbstoffen, ermöglicht die optische Abbildung Messung des transmembranen Aktionspotentiale und Kalzium Transienten mit hoher räumlicher Auflösung ohne physischen Kontakt mit dem Gewebe. Das macht Messungen der kardialen elektrischen Aktivität möglich unter vielen Bedingungen, wo die Verwendung von Elektroden ist unbequem oder unmöglich 1. Zum Beispiel bieten optischen Aufnahmen genaue morphologische Veränderungen des Membranpotentials während und unmittelbar nach der Stimulation und Defibrillation, während konventionelle Elektrode Techniken aus Stimulus-induzierten Artefakten leiden während und nach der Reize, die durch Elektrodenpolarisation 1. Der Langendorff-perfundierten Kaninchen Herz ist eines der am besten untersuchten Modelle des menschlichen Herzens Physiologie und Pathophysiologie. Viele Arten von Herzrhythmusstörungen beobachtet klinisch konnte beim Kaninchen Herzmodell rekapituliert werden. Es wurde gezeigt, dass Wellenmuster in das Kaninchen Herzen während ventrikuläre Arrhythmien, durch wirksame Größe des Herzens und der Wellenlänge des Wiedereintritts bestimmt, sehr ähnlich, die im menschlichen Herzen 2 sind. Es wurde auch gezeigt, dass kritische Aspekte der Erregung und Kontraktion (EG)-Kopplung in Kaninchen Myokard, wie der relative Beitrag der sarkoplasmatischen Retikulum (SR), sehr ähnlich dem menschlichen EC-Kupplung 3 ist. Hier präsentieren wir die grundlegenden Verfahren der optischen Mapping-Experimente in Langendorff-perfundierten Kaninchenherzen, einschließlich der Langendorff Perfusion System-Setup, das optische Mapping-Systeme Einrichtung, die Isolierung und Kanülierung des Herzens, Perfusion und Farbstoff-Färbung des Herzens, Erregung und Kontraktion Entkopplung und Sammlung von optischen Signalen. Diese Methoden können auch das Herz werden von anderen Tierarten als Kaninchen mit Anpassungen an Flussraten, Optik, Lösungen, etc. angewendet Zwei optische Mapping-Systeme beschrieben werden. Die Panorama-Mapping-System wird verwendet, um die gesamte Epikard des Kaninchens Herz 4-7 Karte. Dieses System bietet einen umfassenden Überblick über die Entwicklung der reentrant Schaltungen während Arrhythmogenese und Defibrillation und wurde verwendet, um die Mechanismen von Herzrhythmusstörungen und antiarrhythmia Therapie 8,9 studieren. Die Dual-Mapping-System wird verwendet, um das Aktionspotential (AP) und Kalzium transienten (CAT) gleichzeitig vom selben Blickfeld 10-13 Karte. Dieser Ansatz hat unser Verständnis der Rolle von Calcium in die elektrische alternans und die Induktion von Arrhythmien 14-16 verbessert.

Dieser Artikel beschreibt die grundlegenden Verfahren für die Durchführung optische Mapping-Experimente in der Langendorff-perfundierten Kaninchen Herzen mit dem Panorama-Imaging-System und der Dual-(Spannungs-und Kalzium) Bildgebungsverfahren.

Multiparametrische Optical Mapping der Langendorff-perfundierten Rabbit Heart

Die optische Bildgebung und fluoreszierende Sonden haben die Forschungsmethodik auf dem Gebiet der kardialen Elektrophysiologie in einer Weise maßgeblich vorangebracht, die zuvor nicht ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die kardialen elektrophysiologischen Eigenschaften wie Leitung, Repolarisation, Arrhythmogenese und Kalziumverarbeitung mittels optischer Abbildungstechniken am langsam perfundierten Kaninchenherzen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein intaktes Kaninchenherz isoliert und retrograd über die Aorta perfundiert wird. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, die Oberfläche des Herzens freizulegen, die Kontraktionen des Herzens zu unterdrücken, indem die Erregungs-Kontraktions-Kopplung mit Coler BLEs Statin blockiert wird, und das Myokard anschließend korrekt mit spannungsabhängigen und kalziumempfindlichen fluoreszierenden Indikatoren anzufärben.Anschließend werden mit dem panoramatischen optischen Abbildungssystem Aufnahmen optischer Aktionspotentiale von einem großen Teil des ventrikulären Epikards angefertigt. Die optischen Signale werden dann auf eine rekonstruierte 3D-Geometrie der epikardialen Herzoberfläche abgebildet. Während dieses Schritts können das optische Aktionspotential und der Kalziumtransient gleichzeitig mithilfe des nicht-panoramatischen Doppelbildgebungssystems aufgezeichnet werden.Dieses Verfahren liefert quantitative Daten über das räumliche und zeitliche Myokard, Erregung und Repolarisation sowie kongruente Eigenschaften des Kalziummanagements, die sowohl während eines regelmäßigen Rhythmus als auch bei Vorhof- und Kammerarrhythmien analysiert werden können. Hallo, mein Name ist Dr. Iger Eov. Ich bin Professor für Biomedizinische Technik an der Washington University in St. Louis.Die optische Technik, die wir heute vorstellen, ist eine einzigartige Methode mit einer Reihe von Vorteilen gegenüber herkömmlichen Mikro- und Mikroelektrogrammen, da sie in der Lage ist, zehn- bis zehntausendfach Aktionspotentiale und Kalziumtransienten gleichzeitig aufzuzeichnen. Darüber hinaus ist diese Technik unempfindlich gegenüber Störungen durch elektrische Stimulation und Defibrillation, die Aktionspotentiale, die mittels Elektrogrammen aufgezeichnet werden, stark verfälschen. Außerdem können Kalziumtransienten ausschließlich mit dieser Technik erfasst werden.Es gibt einfach keine Alternative. Diese Methode kann dabei helfen, die zentralen Fragen auf dem Gebiet der kardialen Elektrophysiologie zu beantworten, wie beispielsweise die Mechanismen der Induktion, Aufrechterhaltung und Beendigung lebensbedrohlicher atrialer und ventrikulärer Arrhythmien sowie die Funktionsmodellierung der Erregungsleitung und Erregungs-Kontraktions-Kopplung bei Erkrankungen wie angeborenen Herzfehlern, Stoffwechselerkrankungen und Herzinsuffizienz. Nach der Vorbereitung auf die Operation wird ein Kaninchen mit einem Cocktail aus Natriumpentobarbital und Heparin euthanasiert.Sobald das Kaninchen nicht mehr auf einen Schmerzreflex reagiert, öffnen Sie den Brustkorb und entfernen Sie Herz und Lungen. Führen Sie einen Schnitt am oberen Ende der Aorta ascendens durch, bevor alle Äste des Aortenbogens, und schalten Sie die Pumpe ein, um den Fluss der Tyro-Lösung im nicht rezyklierenden LRF-Perfusionssystem zu starten. Befestigen Sie das Herz schnell an der Aortenkanüle mit 16 Gauge, die mit dem LOR-Perfusionssystem verbunden ist.Spülen Sie die Luft aus der Aorta aus und verschließen Sie die Aortakanüle, sobald die Perfusion vollständig ist. Öffnen Sie unverzüglich das Perikard. Entfernen Sie anschließend das umgebende Lungentrachealfett sowie das Bindegewebe um das Herz herum.Es ist sehr wichtig, eine Flüssigkeitsansammlung im linken Ventrikel zu verhindern, da dies eine Ischämie verursachen würde. Führen Sie daher ein Silikon-Drainageröhrchen durch eine Lungenvene und die Mitralklappe in den linken Ventrikel ein. Bringen Sie nun das Herz mit der Kanüle an das recirkulierende Langendorff-Perfusionssystem, das mit einem optischen Abbildungssystem ausgestattet ist.Platzieren Sie das Herz in einer speziell angefertigten sechseckigen Kammer und verbinden Sie die Kanüle mit dem Perfusionssystem. Überwachen Sie den aortalen Druck mithilfe eines Druckwandlers und halten Sie diesen durch Anpassung der Flussrate der Perfusionspumpe bei etwa 60 ± 5 mmHg. Halten Sie den pH-Wert bei etwa 7,35 ± 0,05. Schalten Sie das Raumlicht aus und injizieren Sie langsam die lichtempfindliche BLEs-Statin-Stammlösung über die Injektionsöffnung im Luftblasenfänger, der sich oberhalb der Kanüle befindet. Um eine Konzentration von 10 Mikromolar BLEs Statin zu erreichen, injizieren Sie langsam 0,1 Milliliter BLEs Statin. Warten Sie nach jeder Bolusinjektion, bis sich der Druck stabilisiert hat, bevor Sie die nächste Injektion vornehmen.Platzieren Sie die Fotodioden-Arrays oder PDAs in drei gleichmäßig verteilten Winkeln um das Herz herum. Fokussieren Sie dann auf jedem PDA das Bild des Herzens auf der Mattscheibe der Bildebene. Passen Sie die Position der Kanüle in der hexagonalen Kammer und jedes PDA an, bis das Herz in das Sichtfeld aller drei PDAs passt.Nehmen Sie dann ein Bild jedes fokussierten Bildes auf dem Mattglas auf. Injizieren Sie langsam 10 bis 20 Mikroliter der D vier Anep-Standardlösung über die Injektionsöffnung in der Luftblasenfalle in die Perfusionslösung. Warten Sie anschließend drei Minuten.Als Nächstes platzieren Sie die Reizsonde vorsichtig an der gewünschten Stelle. Hier wird sie in der Mitte der vorderen Ansicht des Herzens platziert. Beginnen Sie gleichzeitig mit der optischen Ableitung von den PDAs.Stellen Sie sicher, dass keine Bewegungsartefakte im optischen Signal vorhanden sind und dass das Signal-Rausch-Verhältnis für die nachfolgende Datenanalyse ausreichend ist. Schalten Sie nach Beendigung das Raumlicht ein und fertigen Sie eine fotografische Aufnahme des Herzens an, indem Sie von einer Kamera, die an der Position eines der PDAs platziert ist, jeweils ein Foto pro 10 Grad Drehung aufnehmen. Danach fahren Sie mit der Reinigung des Perfusionsystems fort.Platzieren Sie das kanülierte Herz in eine radnaughty Glaswanne und verbinden Sie die Kanüle mit dem Perfusionsystem. Befestigen Sie das Herz durch Fixierung an der ventrikulären Spitze und den Vorhöfen am Silikonboden der Wanne. Um das Herz zu immobilisieren, schalten Sie das Raumlicht aus und injizieren Sie langsam BLEs Statin über die Injektionsöffnung, um die Bewegung der Lösungsoberfläche zu verringern.Platzieren Sie eine Glasabdeckung über der epikardialen Oberfläche. Dieser Teil des Verfahrens wird normalerweise im Dunkeln durchgeführt, hier jedoch im Licht gezeigt. Um die Videobildqualität zu verbessern, bewegen Sie das duale Abbildungssystem über das Herz.Richten Sie nun die beiden CMO-Kameras auf dasselbe Sichtfeld aus. Positionieren Sie anschließend die Lichtleiter für zwei Halogenlampen mit Anregungsfilter. Färben Sie das Herz, indem Sie 10 bis 20 Mikroliter des spannungsempfindlichen Farbstoffs RH 237 über die Injektionsöffnung hinzufügen.Fügen Sie dann 200 µL Road 2:00 AM mit Onic F1 27 in einem 1:1-Gemisch über den Blasenfalle-Port hinzu. Warten Sie etwa 20 Minuten, um die DS-ifizierung von Road 2:00 AM abzuwarten, bevor die Abbildung beginnt. Führen Sie nun eine Testaufnahme durch.Schalten Sie die Überleitungs-Pumpe aus, um Bewegungen an der Oberfläche der Lösung zu vermeiden. Schalten Sie die Halogenlampen ein und nehmen Sie eine optische Aufnahme von beiden Kameras auf. Schalten Sie dann das Anregungslicht aus.Schalten Sie die Überströmungspumpe ein und überprüfen Sie die Qualität der optischen Signale. Falls das Signal schwach ist, färben Sie das Herz erneut mit zusätzlichem RH 237 und Road 2:00 AM nach. Wenn Bewegungsartefakte auftreten, geben Sie sofort zusätzliche BLE-Statin hinzu, um die Bewegung zu unterdrücken, und stellen Sie sicher, dass alles ordnungsgemäß ist. Fahren Sie mit dem geplanten Experiment fort und reinigen Sie anschließend das System.Wenn abgeschlossen, wurde das panoramatische optische Abbildungssystem verwendet, um diese vordere Ansicht eines Lang-Endorf-perfunden Kaninchenherzens darzustellen. Zum Vergleich zeigt eine Rekonstruktion der Herzgeometrie dieselbe vordere Ansicht. Die hier dargestellte entfaltete epikardiale Oberfläche ist nach Phase farbkodiert.Das Herz befand sich in einer Episode einer tachykarden Arrhythmie, die von fünf Stellen um den Rotor herum ausging. Optische Aktionspotentiale wurden dargestellt. Hier in Rot ist eine Aktivierungswellefront sichtbar, die während eines Zyklus einer stabilen Reentry-Arrhythmie fortschreitet.Die Wellenfront dreht sich im Uhrzeigersinn um eine Phasensingularität an der vorderen Oberfläche des Herzens. Die Repolarisation ist in transparentem Blau dargestellt, um die Visualisierung der Wellenfronten auf der hinteren Oberfläche zu ermöglichen. Das Herz wurde mit dem Doppelmappingsystem analysiert, um die simultane Abbildung von Aktionspotentialen und Kalziumtransienten zu zeigen.Eine vergrößerte Darstellung der Aufnahmen von einer Stelle zeigt Aktionspotentiale in Blau und Kalziumtransienten in Rot. Eine Reihe von Beispielkurven wird von einer Anordnung gleichmäßig verteilter Stellen gezeigt, wie durch die Punkte auf dieser Vorderansicht dargestellt. Diese Daten wurden mit einer optischen Auflösung von 200 Mikrometer mal 200 Mikrometer pro Pixel erfasst.Die Implikationen der Therapie erweitern die Defibrillationstherapie bei atrialen und ventrikulären 10 K-Arrhythmien, da wir die Wirkung starker elektrischer Reize während der Elektrotherapie direkt visualisieren können. Keine alternative Methode ist dazu in der Lage. Mithilfe dieser Methode haben wir eine neuartige, schmerzfreie Defibrillationstherapie mit niedriger Spannung für Vorhofflimmern und ventrikuläre Tachykardie entwickelt und validiert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieser Artikel beschreibt ein hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung Technik optisch Bild Aktionspotential Bewegung auf der Oberfläche von Langendorff-perfundierten Rattenherzen mit einem potentiometrischen Farbstoff (di-8-ANEPPS).

Optische Abbildung von Langendorff-perfundierten Rattenherzen

Dieser Bericht enthält eine detaillierte Beschreibung der Methodik und Ergebnisse der gleichzeitigen endokardiale und epikardialen optische Abbildung der elektrischen Erregung in der intakten linken Vorhof eines Langendorff-perfundierten Schafe Herzen während stretch-induzierten Vorhofflimmern.

High-Resolution Endocardial und Epikardiale Optical Mapping in ein Schaf Modell Stretch-Induced Vorhofflimmern

Dieses Papier beschreibt die Präparation Verfahren, Instrumental-Setup, und experimentellen Bedingungen bei der optischen Abbildung von Transmembranpotential (Vm) und intrazellulären Calcium-Transienten (CAT) in intakten isolierten Langendorff perfundierten Maus Herzen.

Optische Mapping von Aktionspotentialen und Calcium Transienten in der Maus Herz

In diesem Video führen wir die retrograde Langendorff-Perfusion eines isolierten Mausherzens durch. Während des Eingriffs wird die Herzaktivität des Herzens aufrechterhalten, indem es retrograd mit einer Perfusionslösung über die Herzkranzgefäße perfundiert wird, wobei eine Kanüle in die aufsteigende Aorta eingeführt wird. Das Modell wird verwendet, um die kardiale Pathophysiologie des Herzens zu untersuchen.

Retrograde Langendorff-Herzperfusion: Eine ex vivo-Technik zur Perfusion isolierter Mausherzen

Dieser Artikel beschreibt das detaillierte Protokoll und Anlagen für die duale optische Abbildung von Transmembranpotential (V m) und freie inner Retikulum (SR) notwendig Ca 2+ in der Langendorff-perfundierten Kaninchenherzen. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Beobachtung und Quantifizierung von V m und SR Ca 2+ Dynamik im intakten Herzens.

Optische Kartierung der Intra-Retikulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Und Transmembranpotential in der Langendorff-perfundierten Kaninchen Herz

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die optische Abbildung der elektrischen Aktivität aus dem rechten Vorhof Maus und vor allem die sinuatrialer Knoten, mit einer hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung.

Hochauflösende optische Abbildung der Maus sinuatrialer Knoten

Dieses Protokoll beschreibt die elektrophysiologische Bewertung der murinen Atrien mit Hilfe einer optischen Mapping-Systems mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung, darunter zweite Aufnahmen der Membran Spannung und Ca2 + vorübergehend unter programmiert Stimulation durch eine spezielle Elektroden-Katheter.

Elektrophysiologische Bewertung der murinen Atria mit hochauflösenden optischen Mapping

Ziel dieser Studie war es, eine Methode zur Untersuchung der Herzdynamik anhand eines translationalen Tiermodells zu etablieren. Der beschriebene experimentelle Ansatz beinhaltet eine duale Emissions-Optokardiographie in Verbindung mit einer elektrophysiologischen Studie zur Beurteilung der elektrischen Aktivität in einem isolierten, intakten Schweineherzmodell.

Optokardiographie und Elektrophysiologie Studien an Ex Vivo Langendorff-perfundierten Herzen

Dieses Protokoll führt eine optische Dual-Dye-Kartierung von Mausherzen ein, die von Wildtyp- und Knock-in-Tieren mit katecholaminerger polymorpher ventrikulärer Tachykardie betroffen sind, einschließlich elektrophysiologischer Messungen der Transmembranspannung und intrazellulärerCa2+ -Transienten mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung.

Optisches Dual-Dye-Mapping von Herzen aus RyR2R2474S Knock-In-Mäusen mit katecholaminerger polymorpher ventrikulärer Tachykardie

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Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Erfahren Sie die multiparametrische Optical Mapping-Methode zur Untersuchung kardialer Elektrophysiologie, Erregungsleitung und Kalziumhandling am Langendorff-perfundierten Kaninchenherzen.

Multiparametrische Optical Mapping der Langendorff-perfundierten Rabbit Heart

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