Konfokale Zeitraffer-Bildgebung der neuronalen dendritischen Dynamik in retinalen Explantaten der Maus

Beginnen Sie mit einem lebenden postnatalen Maus-Netzhautexplantat, das auf einem Membranfilter montiert und in einer Inkubationskammer unter einem konfokalen Mikroskop platziert wird.

Die Netzhaut wird transfiziert, um ein fluoreszierendes Protein in den Membranen von Starburst-Amakrin-Interneuronen zu exprimieren.

Legen Sie ein vorbenetztes Probengewicht auf die Netzhaut, um sie zu stabilisieren.

Füllen Sie die Kammer mit Puffer.

Halten Sie einen optimalen Pufferfluss und eine optimale Temperatur in der Kammer aufrecht, um die neuronale Lebensfähigkeit zu erhalten.

Positionieren Sie ein Wasserimmersionsobjektiv in der Bildgebungskammer.

Starten Sie die Epifluoreszenzbildgebung.

Das Laserlicht, das durch das Objektiv geleitet wird, regt das fluoreszierende Protein in den Amakrinzellen an.

Die emittierte Fluoreszenz wird durch dasselbe Objektiv erfasst, was eine Visualisierung der markierten Amakrinzellen ermöglicht.

Identifizieren Sie eine hell fluoreszierende Zelle für die Bildgebung.

Stellen Sie die Bildgebungsparameter ein.

Nehmen Sie Bilder in mehreren Z-Ebenen auf, um eine 3D-Visualisierung der vollständigen dendritischen Morphologie zu erhalten.

Führen Sie Zeitraffer-Bildgebung durch, um Veränderungen in der dendritischen Morphologie im Laufe der Zeit zu verfolgen.

Bauen Sie die Inkubationskammer für Live-Imaging zusammen und füllen Sie sie mit sauerstoffreichem aCSF. Schalten Sie die Pumpe und den Temperaturregler ein und achten Sie darauf, dass die Temperatur nicht über 34 Grad Celsius steigt. Es kann bis zu einer Stunde dauern, bis sich die Kammertemperatur stabilisiert hat. Es wird empfohlen, die Inkubationskammer vor Beginn der Netzhautdissektion einzurichten. Eine stabile Kammertemperatur trägt zur Reduzierung der Probendrift bei.

Um den flachen Netzhauthügel in die Perfusionskammer zu übertragen, stoppen Sie die Pumpe und entfernen Sie den aCSF, der sich in der Kammer befindet. Setzen Sie dann die MCE-Scheibe mit der flachen Netzhauthalterung in die Inkubationskammer ein. Befeuchten Sie ein Probengewicht vor, um die Oberflächenspannung zu brechen, und legen Sie es dann auf den flachen Hügel, wobei Sie sicherstellen, dass das Probengewicht auf dem MCE-Papier platziert wird, um die Probendrift zu reduzieren. Füllen Sie die Kammer wieder mit dem erwärmten aLiquf und zirkulieren Sie aLiquf mit etwa 1 Milliliter pro Minute.

Positionieren Sie das Objektivrevolver mit dem 25-fach Wassertauchobjektiv in der Bildgebungskammer. Suchen Sie mit Epifluoreszenzlicht nach markierten Zellen von Interesse und passen Sie das Bildgebungsvolumen an, um dendritische Merkmale von Interesse zu erfassen.

Passen Sie mithilfe einer Nachschlagetabelle, die sowohl übersättigte als auch untersättigte Pixel identifiziert, die Laserleistung so an, dass keine Pixel übersättigt werden. Erfassen Sie das 3D-Bildvolumen und wiederholen Sie die Aufnahme mit der gewünschten Bildrate. Die Bildlautstärke kann zwischen den einzelnen Zeitpunkten angepasst werden, um die Probendrift zu kompensieren.