Bildgebung und Quantifizierung der axonalen Regeneration in axotomisierten retinalen Ganglienneuronen von Ratten

Nehmen Sie eine Co-Kultur von immortalisierten olfaktorischen Gliazellen (OEG) des Menschen und axotomisierten retinalen Ganglienneuronen (RGNs) der Ratte auf einem Deckglas.

OEG-Zellen weisen neuroregenerative Eigenschaften auf, die die axonale Regeneration in RGNs erleichtern.

RGNs sind immunmarkiert, so dass ihre Soma oder Zellkörper rot fluoreszieren, während ihre Axone grün fluoreszieren.

Montieren Sie mit Eindeckmedien das Deckglas mit den Zellen.

Verwenden Sie ein Epifluoreszenzmikroskop, um mehrere Bilder von RGNs aufzunehmen.

Öffnen Sie ein Bild in einer Imaging-Software.

Quantifizieren Sie den Prozentsatz der Neuronen mit den Axonen im Verhältnis zur Gesamtzahl der RGNs.

Verfolgen Sie als Nächstes ein Axon vom Soma bis zum Ende und beginnen Sie mit der Axonverfolgung, um die Längen aller Axone zu bestimmen.

Quantifizieren Sie den axonalen Regenerationsindex, indem Sie die Summe aller axonalen Längen durch die Gesamtzahl der RGNs dividieren.

Montieren Sie die Deckgläser mit Eindeckmedium und halten Sie sie bei 4 Grad Celsius. Verwenden Sie ein 40-faches Objektiv eines Epifluoreszenzmikroskops, um die axonale Regeneration zu quantifizieren. Quantifizieren Sie den Prozentsatz der Neuronen mit Axonen im Verhältnis zur Gesamtpopulation der retinalen Ganglienneuronen.

Verwenden Sie das NeuronJ-Plugin in ImageJ, um den axonalen Regenerationsindex oder die mittlere Axonlänge zu quantifizieren, die die Summe der Längen aller identifizierten Axone dividiert durch die Gesamtzahl der gezählten Neuronen ist, unabhängig davon, ob sie ein Axon darstellten oder nicht. Klicken Sie nach dem Öffnen des Bildes auf Analysieren und stellen Sie den Maßstab gemäß den Mikroskopeinstellungen ein, wobei Sie in Pixeln pro Mikrometer arbeiten. Wählen Sie Ablaufverfolgungen hinzufügen aus, um die Axonverfolgung zu starten, und verfolgen Sie dann die Axone vom Soma bis zum Ende. Klicken Sie auf Ablaufverfolgungen messen, Verfolgungsmessungen anzeigen und Ausführen.