Stereotaktische Mikroinjektion eines viralen Vektors zur Genmanipulation in einem Striatum eines Maus-Jungtiers

Nehmen wir einen genetisch veränderten Mauswelpen, der eine loxP-flankierte STOP-Kassette trägt, die die Expression von rot fluoreszierendem Protein oder RFP blockiert.

Befestigen Sie den Welpen auf einem speziell angefertigten stereotaktischen Rahmen und bedecken Sie ihn mit Eis, um die Narkose aufrechtzuerhalten.

Desinfizieren Sie die Kopfhaut und markieren Sie Lambda als Referenzpunkt.

Richten Sie die Injektionsnadel auf die striatalen Koordinaten relativ zum Lambda aus und punktieren Sie den Schädel.

Ziehen Sie die Nadel auf die Schädeloberfläche zurück und führen Sie sie dann in die Zieltiefe ein.

Injizieren Sie den mit Farbstoff gemischten viralen Vektor mit einer kontrollierten Geschwindigkeit in das Striatum. Der Vektor kodiert für grün fluoreszierende Proteine oder GFPs und Cre-Rekombinase.

Ziehen Sie die Nadel langsam zurück, um einen Rückfluss der Lösung zu verhindern.

Entfernen Sie den Welpen und lassen Sie ihn erholen.

In striatalen Zellen gibt das Virus sein Genom frei, was die Expression von Cre-Rekombinase und GFP ermöglicht. Cre schneidet die loxP-flankierte STOP-Kassette aus und aktiviert die RFP-Expression.

Die gleichzeitige Expression von GFP und RFP bestätigt die erfolgreiche Genmanipulation.

Positionieren Sie den Welpen mit dem Handschuh in der Kopfschale und geben Sie etwas zerstoßenes Eis um die Latexhülle, um die Unterkühlungsanästhesie aufrechtzuerhalten. Schrubben Sie dann den Kopf des Welpen mit 70% Ethanol und lokalisieren Sie den Lambda-Orientierungspunkt. Markieren Sie es mit einem Marker. Richten Sie dann die Nadelspitze auf das Lambda und setzen Sie die vorderen, hinteren und medialen lateralen Koordinaten auf Null.

Ziehen Sie dann mit einem Gehirnatlas den Injektionsarm an die Zielstelle. Zum Beispiel beträgt das Striatum von P2-Welpen 2,4 Millimeter vor dem Lambda, 1,0 Millimeter zu beiden Seiten der Mittellinie und 1,7 Millimeter ventral. Markieren Sie anschließend mit einem Stift die Position des schnellen grünen Farbstoffs auf der PE10-Tube. Beginnen Sie dann, die Nadel langsam durch die Haut und den Schädel zu dringen, bis die Nadelspitze die Oberfläche des Schädels berührt.

Legen Sie die dorsale ventrale Koordinate auf Null fest. Senken Sie dann die Nadel langsam auf die Zielstelle ab. Warten Sie eine Minute, damit das Parenchym wieder in seine normale Form zurückkehrt. Führen Sie dann das Mikroinjektionsprogramm mit 100 Nanolitern pro Minute durch. Beobachten Sie während der Injektion, wie sich der schnelle grüne Farbstoff im PE-Schlauch bewegt.

Es ist wichtig, die Nadel langsam durch die Haut und den Schädel zu dringen, bis die Nadelspitze die Oberfläche des Schädels berührt. Während der Injektion ist unbedingt zu beobachten, wie sich der Fast Green Farbstoff in den PE-Schlauch bewegt.

Warten Sie nach Abschluss der Injektion eine Minute und bringen Sie die Nadel dann langsam auf die Hälfte der eingedrungenen DV-Tiefe. Warten Sie dann weitere 30 Sekunden, bevor Sie mit dem langsamen Zurückziehen der Nadel aus dem Kopf des Welpen fortfahren.

Nach Abschluss der Injektion ist es wichtig, eine Minute zu warten, bevor Sie die Nadel langsam auf die Hälfte der eingedrungenen DV-Tiefe bringen, und dann weitere 30 Sekunden zu warten, bevor Sie die Nadel langsam aus dem Kopf des Welpen ziehen.

Nachdem alle Zielstellen injiziert wurden, wärmen Sie den Welpen 20 Minuten lang in einem 33 Grad Celsius heißen Inkubator auf.

Kontrollieren Sie den Welpen alle fünf Minuten, bis er wieder sternal liegt. Gib den Welpen dann zu seiner Mutter zurück.