Name: Experimentelle Manipulation von Körpergröße zu morphologischen Scaling Relationships in Estimate Drosophila /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Lernen Sie eine Methode zur experimentellen Manipulation der Körpergröße bei Drosophila, um morphologische Skalierungsbeziehungen zwischen Körper- und Flügelgröße zu untersuchen. Diese Technik ermöglicht Einblicke in die evolutionäre Entwicklung morphologischer Merkmale.

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Die Forschung in dieser Studie beschrieben durch einen National Science Foundation Grant (DEB-0805818), um WAF unterstützt wurde, AWS und ID Diese Studie wurde auch durch Zuschüsse IOS-0845847 bis AWS, IOS-0919855 bis AWS und ID-und IOS-0920720 unterstützt WAF

1. Aufzucht und Manipulation von Diät, um Unterschiede in Körpergröße und Flügel Größe produzieren Rational und Überblick. Der Ausdruck der Skalierung Beziehungen letztlich hängt die Entwicklung regulatorischen Prozesse, die Abweichungen zu produzieren in der letzten Orgel und Körpergröße. Diese Prozesse lassen sich am besten von der Arbeit aus ganz metamorphen (dh holometabolen) Insekten wie D. beschrieben melanogaster, wo Organe wachsen als undifferenzierte 'Imaginalscheiben "im grub-like Larve 11,15-17. In Drosophila, sind endgültig Orgel und Körpergröße durch das Wachstum während der Larvenstadien geregelt; Larven durch die ersten und zweiten Larvenstadium wachsen, bis sie eine minimale lebensfähige Gewicht für eclosion (MVW E) erreichen gegenüber dem Beginn des dritten Larvenstadium 18. Hunger vor Erreichen des MVW E verhindert Erwachsenen Schlüpfen. Allerdings erzeugen Larven, die bei MVW E verhungert sind lebensfähig Erwachsenen, wenn auch auf eine sehr kleine Größe. Dies liegt daran, Ernährung während der Entwicklung reduziert reduziert endgültigen Körper und Orgel Größe, nicht nur in Fliegen, sondern in fast allen Tieren 19-21. Durch die Manipulation Verfügbarkeit von Nahrungsmitteln nach MVW E erreicht ist, aber vor der Verpuppung eintritt, ist es möglich, extreme phänotypische Plastizität in der Körpergröße, die sich stark überwiegt anderen Quellen der Variation (z. B. individuelle genetische Variation) zu induzieren. <ol><li> Die Eier werden von der Bevölkerung phänotypisiert werden gesammelt, eingeteilt in Partien von 50 und in Fläschchen mit 10ml von Standard-fly Essen. Da die Eiablage erfolgt kontinuierlich, sind Eier alle 24 Stunden für 3 Tage gesammelt und produziert drei Alterskohorten. </li><li> Als die älteste Kohorte der wandernden Stufe erreicht oder hat gerade erst begonnen sich zu verpuppen, ist die Ernährung Manipulation angewendet. An diesem Punkt, der ältesten Kohorte weit über die MVW E ist, ist die jüngste Kohorte sehr nahe an den MVW E schließen und die verbleibenden Kohorte ist irgendwo zwischen diesen Extremen. So wird Abnehmen von an dieser Stelle sehr große Erwachsene aus der ältesten Kohorte zu produzieren, sehr kleine Erwachsene aus der jüngsten Kohorte und mittelgroßen Erwachsenen aus den verbleibenden Kohorte. Zum Entfernen der Larven aus dem Fläschchen, ca. 5 ml 40% Saccharose-Lösung ist es, alle Fläschchen aufgenommen. Um kostenlos den Larven, das Essen ist für 15-20 Minuten auf einem Schüttler Tabelle zu einer mittleren Geschwindigkeit bewegt. </li><li> Schwimmende Larven sind aus der Saccharose-Lösung mit einer Geldstrafe (00) Pinsel, platziert in Fläschchen mit einem feuchten Wattebausch und erlaubte sich zu verpuppen entfernt. Alternativ könnte Larven auf einem unverdaulichen Lebensmittelzusatzstoff wie Methylcellulose 22 platziert werden. </li></ol> 2. Abschätzung der Körpergröße Rational und Übersicht. Frühere Studien zeigen, dass Thorax Länge weniger als ideal Proxy für die gesamte Körpergröße 22 ist. Stattdessen verwenden wir Puppenstadium Größe als Maß für die Körpergröße. Maximale Körpergröße ist bei der Einstellung der Fütterung, die Verpuppung vorausgeht fixiert. Als Ergebnis gibt es eine enge Korrelation zwischen Puppenstadium Größe und erwachsenen Körper Größe 23. <ol><li> Puppen sind Bauchseite angeordnet auf Objektträger aus Glas und aufgenommen mit einer digitalen Kamera, die an einem Binokular. Jedes Bild wird erfasst, eine eindeutige Identifizierung Code und übertragen auf einem Computer über einen Live-Feed Anschließen der Digitalkamera an den Computer. </li><li> Abgebildet Puppen sind auf die individuellen 2 ml epitubes enthält 1 ml essen fliegen, mit dem einzigartigen Code für die einzelnen markierten bewegt, und durchstach mit Luftlöchern, um den Gasaustausch zu ermöglichen. </li><li> Puppenstadium Größe ist als die Anzahl der Pixel des Puppenstadium Silhouette geschätzt. Andere Größen Metriken können auch verwendet werden. </li></ol> 3. Trait (Flügel) Größenabschätzung Rational und Übersicht. Um Bild-Flügel, verwenden wir ein "Flügel-Grabber" 24, die und zieht hält den Flügel eines leben, betäubt fliegen senkrecht zu ihrer Körper. Pressed zwischen zwei Glasscheiben, ermöglicht dies dem Flügel als ein zweidimensionales Objekt abgebildet werden. <ol><li> Fliegen sind betäubt leicht mit CO 2 und in Position gebracht in den Flügel-Grabber auf einem Binokular mit einer digitalen Kamera, die an einen Computer angeschlossen ist eingebaut. </li><li> Der Flügel ist abgebildet und unter dem einzigartigen Code für die einzelnen gespeichert. </li><li> Flügel Größe kann anhand der minimalen konvexen Polygon, das marginal festen Landmarken umschreibt oder als die Pixelzahl des Flügels Silhouette werden. </li></ol> 4. Scaling Beziehung Schätzung <ol><li> Die Daten werden über die Kohorten zusammengefasst, sondern getrennt nach Geschlecht und transformierten anmelden. </li><li> Scaling Beziehungen sind, um die Größe von Daten mit Typ II (dh reduzierte Hauptachse) Regression (siehe eine Übersicht in 12) und die Parameter für jede Gruppe geschätzt fit. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Zelt "&gt; Unsere Ernährung Manipulation produziert ein breites Spektrum an Körpergrößen (Abbildung 1) und Trait Größen (Abbildung 2). Trägt man die Log-transformierten Merkmale gegeneinander verrät ihre Muster von Kovariation innerhalb einer bestimmten biologischen Gruppe und ermöglicht Montage der Skalierung Beziehung der Gruppe (Abbildung 3). Extraktion der Skalierung Beziehung Parameter, die beschreiben, wie Form Waagen mit Körpergröße ermöglicht den Vergleich, wie Form covaries mit einer Größe zwischen den Gruppen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig1.jpg"> Abbildung 1. Pupa von Extremen der Größenverteilung über Ernährung Manipulation hergestellt nach Personen erreichen die MVW E. Actual Puppenstadium Bilder sind auf der linken Seite mit den entsprechenden Silhouetten für die Messung von Puppenstadium Größe auf der rechten Seite angezeigt. Skala bar beträgt 1mm. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig2.jpg"> Abbildung 2. Flügel von den Extremen des Körpers Größenverteilung über Ernährung Manipulation hergestellt wurde, nach Personen zu erreichen die MVW E. Actual Flügel Bilder sind auf der linken Seite mit den entsprechenden Silhouetten für die Messung der Flügel Größe auf der rechten Seite gezeigten. Skala bar beträgt 1mm. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3162/3162fig3.jpg"> Abbildung 3. Wing-Körpergröße-Skalierung für Drosophila melanogaster nach Geschlecht. Transformierten Login-Daten für Einzelpersonen beiderlei Geschlechts, die voll-fed (dunkle Kreise), verhungert ein (graue Kreise) oder zwei Tage (offene Kreise) als Larven wurden. Typ II Regressionsgerade ist für jedes Geschlecht dargestellt. Zwischen jeder Altersgruppe, Rückgang der durchschnittlichen Flügelfläche von ~ 0,1 mm (~ 7%) und ~ 0,2 mm (~ 8%) auf, die Erhöhung der Gesamtreichweite von Phänotypen beobachtet. Die Regressionen zeigen, dass Frauen etwas hypoallometric für diese Skalierung Beziehung (Steigung 0,96) sind, während Männer etwas hyperallometric (Steigung 1,06) sind.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Morphologische Skalierung ist Gegenstand intensiver Untersuchungen in der Evolutionsbiologie seit fast einem Jahrhundert. In jüngerer Zeit hat die unmittelbare Grundlage der Regulation des Wachstums und Skalierung zunehmend an Bedeutung in der Entwicklung, Physiologie und Genetik (siehe zB Beiträge in 12,15,23-25). Unsere Methodik ermöglicht Abschätzung der morphologischen Skalierung Beziehungen über das gesamte Spektrum der Zug-und Körpergrößen. Dies kann wichtig sein, wie trait Größe kann nicht linear mit der Körpergröße (zB 13,14). Dies kann jedoch nicht sichtbar sein, wenn die Tiere nur unter idealen Laborbedingungen aufgezogen werden. Obwohl unser Protokoll wurde ausdrücklich Schätzung der Flügel-Körper-Größe Skalierung Beziehung in Drosophila erlauben entwickelt, kann es mit Trait-spezifische Modifikation verwendet werden, um die Skalierung Beziehung für alle morphologischen Merkmals in Fliegen zu schätzen. Ebenso kann die Ernährung Manipulation wahrscheinlich benutzt, um das gesamte Spektrum der Zug-und Körpergrößen in anderen voll metamorphen Insekten produzieren; solche Anwendungen erfordern einfach wissen, wann der MVW E erreicht wird und die Anwendung der Manipulation an diesem Punkt in der Ontogenese.

experimentelle manipulation von körpergröße zu morphologischen scaling relationships in estimate drosophila</em

Experimental Manipulation of Body Size to Estimate Morphological Scaling Relationships in Drosophila

Die Skalierung von Körperteilen ist ein zentrales Merkmal der tierischen Morphologie 1-7. Innerhalb der Arten und morphologischen Merkmale richtig, um den Körper für den Organismus zu funktionieren proportioniert müssen, größere Personen haben in der Regel größeren Körperteile und kleinere Individuen haben in der Regel kleineren Körperteilen, ist so dass sich insgesamt der Körperform einer ganzen Reihe von erwachsenen Körper Größen beibehalten. Die Forderung nach richtigen Proportionen bedeutet, dass Individuen innerhalb der Arten in der Regel eine geringe Variation der relativen Eigenschaft size. Im Gegensatz dazu relativ Merkmal Größe stark variieren zwischen den Arten und ist eine primäre Mechanismus, durch den morphologischen Vielfalt entsteht. Über ein Jahrhundert vergleichende Arbeit hat diese intra-und interspezifische Muster 3,4 etabliert. Vielleicht ist die am weitesten verbreitete Ansatz dieser Variation zu beschreiben, ist die Skalierung Beziehung zwischen der Größe von zwei morphologischen Merkmale mit der allometrischen Gleichung berechnen y = bxα, wobei x und y sind die Größe der beiden Merkmale, wie Orgel und Körper Größe 8 , 9. Diese Gleichung beschreibt die innerhalb der Gruppe (zB Arten, Bevölkerung) Skalierung Beziehung zwischen zwei Eigenschaften, da beide in der Größe variieren. Log-Transformation dieser Gleichung ergibt sich eine einfache lineare Gleichung, log (y) = log (b) + αlog (x) und log-log Parzellen von der Größe der verschiedenen Merkmale von Individuen der gleichen Art in der Regel zeigen lineare Skalierung mit einem Intercept von log (b) und einer Neigung von α, die so genannte &quot;allometrischen Koeffizient&quot; 9,10. Morphologische Unterschiede zwischen den Gruppen ist durch Unterschiede in der Skalierung Beziehung fängt oder Hängen für ein bestimmtes Merkmal Paar beschrieben. Folglich Variation der Parameter der allometrischen Gleichung (b und α) elegant beschreibt die Form Veränderung der Beziehung zwischen Orgel und Körpergröße innerhalb und zwischen biologischen Gruppen (siehe 11,12) erfasst. Nicht alle Züge linear mit einander oder mit der Körpergröße (zB 13,14) sind also morphologische Skalierung Beziehungen sehr informativ, wenn die Daten aus dem gesamten Spektrum von trait Größen getroffen werden. Hier beschreiben wir, wie einfach experimentelle Manipulation der Ernährung verwendet werden, um das gesamte Spektrum der Körpergröße bei Insekten produzieren. Dies erlaubt eine Abschätzung der vollen Skalierung Beziehung für einen bestimmten Paar von Merkmalen, so dass eine vollständige Beschreibung der Form covaries mit einer Größe und einer robusten Vergleich der Skalierung Beziehung Parameter unter biologischen Gruppen. Obwohl wir uns auf Drosophila, sollte unsere Methodik werden für nahezu alle voll metamorphen Insekten.

Morphologische Skalierung Zusammenhänge erfassen und beschreiben organismal Form. Wir präsentieren eine Methode zur morphologischen Skalierung Beziehungen über das natürliche Verbreitungsgebiet der Körpergrößen in vollem Umfang metamorphen Insekten zu messen. Mit einer einfachen Diät Manipulation erhöhen wir die Verteilung der Zug Größen ermöglichen die genaue Beschreibung der Form und Größe co-variieren.

Experimentelle Manipulation von Körpergröße zu morphologischen Scaling Relationships in Estimate Drosophila</em

Die Skalierung von Körperteilen ist ein zentrales Merkmal der Tiermorphologie1-7. Innerhalb einer Art müssen morphologische Merkmale in einem korrekten Verhältnis zum Körper stehen ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, durch eine zeitlich gesteuerte Manipulation der Nahrungsverfügbarkeit während der Entwicklung eine breite Spanne an Körperegrößen zu erzeugen, die anschließend zur Abschätzung der Skalierungsbeziehung zwischen morphologischen Merkmalen verwendet werden kann. Zunächst werden über einen Zeitraum von drei Tagen Eier aus derselben Fliegenpopulation gesammelt, wodurch drei Alterskohorten entstehen. Sobald die älteste Larvenkohorte mit der Verpuppung beginnt, werden die Larven aller Kohorten von der Nahrung entfernt.Das Ergebnis dieser Ern&auml;hrungsmodifikation ist ein vergr&ouml;&szlig;erter Bereich der Gr&ouml;&szlig;envariation der Puppen. Anschlie&szlig;end werden Bilder der Pupillen und der Fl&uuml;gel erwachsener Tiere von allen Individuen aufgenommen, um die morphologische Skalierungsbeziehung zwischen K&ouml;rper- und Fl&uuml;gelgr&ouml;&szlig;e sch&auml;tzen zu k&ouml;nnen. Letztendlich werden Ergebnisse erhalten, die zeigen, wie die Fl&uuml;gelgr&ouml;&szlig;e mit dem gesamten m&ouml;glichen Bereich der K&ouml;rpergr&ouml;&szlig;e skaliert, indem eine lineare Regression vom Typ zwei an die Daten angepasst wird.In dieser Studie verwenden wir eine entwicklungsgemäß zeitlich gesteuerte Manipulation des Zugangs zu Nahrung, um experimentell die Variabilität der Körperform bei erwachsenen Fliegen zu erhöhen. Dies ermöglicht es uns, morphologische Skalierungsbeziehungen über den gesamten Bereich der Körperformen zu schätzen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Expression und Evolution morphologischer Skalierung zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung der unmittelbaren Grundlagen für die Variabilität der Parameter von Skalierungsbeziehungen zwischen biologischen Gruppen.Bringen Sie eine Population von Fliegen in eine Paarungskammer und sammeln Sie anschließend über einen Zeitraum von drei Tagen alle 24 Stunden die Eier. Erstellen Sie dadurch letztendlich drei Alterskohorten mithilfe eines Stereomikroskops. Überführen Sie jeweils 50 Eier jeder Kohorte in Gefäße, die 10 Milliliter Standardnahrung für Fliegen enthalten.Inkubieren Sie die Gefäße bei der gewünschten Temperatur für die Larvenentwicklung. Wenn der älteste Kohortenabschnitt das Wandering-Stadium erreicht, ist es Zeit, die Diätmanipulation durchzuführen, indem die Larven von der Nahrung entfernt werden. Zu diesem Zeitpunkt sind die Larven der ältesten Kohorte bereits deutlich über dem minimalen lebensfähigen Gewicht für die Einschlussbildung und werden nahe der natürlichen Maximalkörpergröße liegen.Larven der mittleren Kohorte haben das minimale lebensfähige Gewicht überschritten, werden jedoch kleinere Erwachsene hervorbringen als Larven der ältesten Kohorte. Larven der jüngsten Kohorte liegen sehr nahe am minimalen lebensfähigen Gewicht und werden deshalb sehr kleine Erwachsene hervorbringen. Um die Larven von der Nahrung zu entfernen.Geben Sie etwa fünf Milliliter einer 40%igen Saccharoselösung in die Gefäße und schütteln Sie 15 bis 20 Minuten lang auf einem Rütteltisch bei mittlerer Einstellung. Entfernen Sie nach dem Schütteln die schwimmenden Larven mit einem feinen Pinsel aus der Saccharoselösung und bringen Sie sie nach Kohorte getrennt in Gefäße mit einem feuchten Wattepfropfen zur Feuchtigkeitsversorgung. Inkubieren Sie bei der gewünschten Temperatur, bis die Verpuppung eintritt.Ordnen Sie die Puppen mit der Bauchseite nach oben auf einem Objektträger an. Sobald die Puppen positioniert sind, nehmen Sie Bilder mit einer an das Mikroskop angeschlossenen Digitalkamera auf. Stellen Sie sicher, dass die Einstellungen so konfiguriert sind, dass jede Puppe als dunkle Silhouette vor weißem Hintergrund erscheint.Nach der Bildaufnahme jedes Puppen in ein einzelnes zwei Milliliter fassendes Epit-Röhrchen mit einem Milliliter Fliegenfutter überführen. Die Pupillengröße als Anzahl der Pixel der Pupillensilhouette schätzen. Andere Größenmetriken wie Länge oder Breite können ebenfalls unter einem Stereomikroskop verwendet werden.Betäuben Sie die Fliege leicht mit Kohlendioxid und positionieren Sie sie mithilfe eines Flügelhalters, einem Sauggerät, das den Flügel zwischen zwei Glasplättchen zieht und senkrecht zum Körper der Fliege fixiert. Obwohl in dieser Studie ein Flügelhalter verwendet wird, um Flügel lebender Fliegen abzubilden, können Flügel und andere Merkmale auch mit normalen Werkzeugen präpariert und abgebildet werden. Nehmen Sie den Flügel mit der an den Computer angeschlossenen Mikroskopkamera auf und notieren Sie das Geschlecht der Fliege. Nachdem der Flügel aufgenommen und gespeichert wurde, schätzen Sie die Flügelgröße entweder anhand des minimalen konvexen Polygons, das die randständigen festen Landmarken umschließt, als lineare Messung oder anhand der Pixelanzahl der Flügelkontur. Die hier abgebildeten Puppen zeigten aufgrund der Futtermanipulation die Extrema der Größenverteilung.Nachdem die Puppe das minimale lebensfähige Gewicht für die Einschlussbildung erreicht hat. Ebenfalls dargestellt sind die entsprechenden Silhouetten zur Messung der Pupillengröße. Die entsprechenden Flügelbilder derselben Individuen an den Extremen der Größenverteilung sind hier neben der Silhouette abgebildet.Wird verwendet, um die Flügelgrößenextraktion der Skalierungsbeziehung abzuschätzen. Parameter, die beschreiben, wie die Flügelgröße mit der Körperform skaliert, ermöglichen den Vergleich, wie die Gesamtform mit der Größe zwischen Gruppen korreliert. Hier werden Daten für Individuen jedes Geschlechts gezeigt, die als Larven voll gefüttert waren oder einen Tag beziehungsweise zwei Tage lang gehungert haben.Obwohl die einzelnen Arbeitsschritte dieses Verfahrens schnell sind, kann es insgesamt aufwendig sein. In der Regel benötigt man etwa 350 Arbeitsstunden, um rund 3.500 Fliegen von der Ei- bis zur erwachsenen Stufe zu verarbeiten. Mit Übung können die Einzelpersonen ihre Bearbeitungszeiten erheblich verbessern, und dieses Verfahren kann auch zur Messung weiterer morphologischer Merkmale verwendet werden, wodurch die Abschätzung zusätzlicher morphologischer Skalierungsbeziehungen ermöglicht wird.

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In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die Implementierung der Expansionsmikroskopie in frühen Drosophila-Embryonen vorgestellt, um eine hochauflösende Bildgebung mit einem konventionellen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop zu erreichen.

Verwendung von Expansionsmikroskopie zur physikalischen Vergrößerung ganzer Drosophila-Embryonen für hochauflösende Bildgebung

Hier stellen wir einen schnellen, kostengünstigen Workflow für die hochauflösende Bildgebung von erwachsenen Drosophila-Augen vor, um Musterbildung und Wachstumsdefekte zu quantifizieren. Wir beschreiben unser Protokoll für die Probenvorbereitung durch Punktmontage, hochauflösende Bildaufnahme und Bildanalyse.

Ein schneller, einfacher Workflow zur Quantifizierung externer adulter Drosophila-Strukturen

Wir beschreiben eine physikalische Verengungsmethode, um Mini-Embryonen aus Xenopus laevis-1-Zell-Embryonen herzustellen.

Physische Manipulation zur Erzeugung von Xenopus-Mini-Embryonen

Experimentelle Ansätze zur Tissue Engineering

Lernen Sie eine Methode zur experimentellen Manipulation der Körpergröße bei Drosophila, um morphologische Skalierungsbeziehungen zwischen Körper- und Flügelgröße zu untersuchen. Diese Technik ermöglicht Einblicke in die evolutionäre Entwicklung morphologischer Merkmale.

Experimentelle Manipulation von Körpergröße zu morphologischen Scaling Relationships in Estimate Drosophila

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