Hemmung der neuronalen Aktivität und deren elektrophysiologischer Nachweis bei einer Ratte

Beginnen wir mit einer anästhesierten Ratte, die in einem stereotaktischen Rahmen gesichert ist und deren Schädel freigelegt ist.

Anhand der anatomischen Orientierungspunkte, des Bregmas und des Lambdas, lokalisieren Sie den Colliculus superior, eine tiefe Gehirnstruktur, die für die Verarbeitung visueller Informationen verantwortlich ist.

Bohren Sie, um einen Knochenlappen zu erstellen, entfernen Sie ihn und tragen Sie einen Puffer auf, um das freiliegende Gehirn mit Feuchtigkeit zu versorgen.

Eine Injektionsrodenanordnung, die aus einer Mikropipette mit einer Elektrode besteht, die an einer Mikrospritze befestigt ist, positionieren.

Die Mikropipette enthält eine inhibitorische Neurotransmitterlösung zur Unterdrückung der neuronalen Erregbarkeit, während die Elektrode gleichzeitig die neuronale Aktivität aufzeichnet.

Senken Sie die Injektionsrode in den Colliculus superior ab und bedecken Sie die freiliegende Oberfläche mit geschmolzenem Agar, um eine Austrocknung zu verhindern.

Gegenwärtiges Licht blitzt im Auge auf, um Neuronen zu stimulieren und synchronisierte Aktionspotentiale hervorzurufen.

Injizieren Sie den Neurotransmitter, der an seine Rezeptoren bindet und den Einstrom von Chloridionen auslöst.

Dieser Einstrom hyperpolarisiert das Membranpotential und unterdrückt dadurch Aktionspotentiale.

Da die Konzentration der Neurotransmitter im Laufe der Zeit abnimmt, erholt sich die neuronale Aktivität.

Um die Aufnahme-Injektionspipetten vorzubereiten, ziehen Sie zunächst eine 7 Zentimeter große Kapillare mit einem Außendurchmesser von 1 Millimeter. Stellen Sie bei einem COP Vertical Modell 720 oder einem ähnlichen Gerät die Heizung auf 18 und das Magnetventil auf eins. Brechen Sie dann mit Handschuhen die Spitze manuell ab, um eine Öffnung zu schaffen, und überprüfen Sie unter einem Mikroskop, ob der Innendurchmesser zwischen 30 und 40 Mikrometern liegt. Messen Sie dies mit dem Lineal des Suchers. Es wird eine relativ niedrige Impedanz von 0,3 bis 0,6 Megaohm erzeugen.

Führen Sie dann vom nicht verjüngten Ende einen etwa 7 Zentimeter langen Silberdraht in die Pipette ein und lassen Sie 1 bis 2 Zentimeter aus der Pipette heraushängen. Biegen Sie diesen überschüssigen Draht orthogonal zur Kapillare. Nehmen Sie als Nächstes eine 30-Gauge-Injektionsnadel und tragen Sie flexiblen Kunststoffkleber auf den Schaft auf. Führen Sie dann die Nadel langsam so weit wie möglich in die Pipette ein.

Fügen Sie mehr Klebstoff hinzu, um eine Abdichtung an der Verbindungsstelle zwischen Pipette und Nadel zu schaffen. Lassen Sie die Baugruppe mit der Pipettenspitze nach oben ca. 12 Stunden trocknen. Nachdem Sie die Ratte betäubt und in einen stereotaktischen Rahmen gesetzt haben, tragen Sie eine Augensalbe auf und rasieren Sie den Kopf sauber.

Nach dem Auftragen eines Lokalanästhetikums und der Bestätigung eines chirurgischen Anästhesieplans fahren Sie mit dem Einschneiden der Kopfhaut entlang des Mittelstreifens mit einer Skalpellklinge Nummer 10 fort. Dadurch werden die koronalen und sagittalen Nähte freigelegt. Identifizieren Sie dann mit einem chirurgischen Spatel die anatomischen Referenzen von Lambda und Bregma.

Passen Sie die Position des Kopfes so an, dass diese Orientierungspunkte in derselben horizontalen Ebene liegen. Dann nullieren Sie einen feinen starren Zeiger wie ein Glasrohr auf das Bregma. Passen Sie als Nächstes die Position des Rohrs anhand der Koordinaten des Bregmas an eine interessante Stelle an.

Zeichnen Sie mit einem Edding ein Quadrat um den Zielbereich für die Kraniotomie. Entfernen Sie nun mit dem chirurgisch sterilisierten Bohrer langsam den Knochen entlang der Markierungen. Beginnen Sie mit so wenig Druck wie möglich und halten Sie den Bohrer in Bewegung, um kopfinduzierte Gewebeschäden durch Reibung zu vermeiden.

Wenn der Knochen dünn geworden ist, entfernen Sie den quadratischen Abschnitt vorsichtig mit einer Pinzette. Die Dura mater muss nicht entfernt werden, da der Injektionsstab in sie eindringt. Halten Sie in Zukunft die freiliegende Hirnrinde mit Liquor cerebrospinalis gespült. Bereiten Sie die Injektionsrode vor, indem Sie zuerst eine 5- bis 10-Mikroliter-Spritze mit Mineralöl füllen. Bereiten Sie als nächstes das gewünschte Medikament mit einem Farbstoff in physiologischer Kochsalzlösung vor. Hier werden 0,5% Chicago Sky Blue mit 300 mikromolaren GABA gemischt.

Füllen Sie nun die Injektionspipette, indem Sie zuerst eine 1-Milliliter-Spritze mit der vorbereiteten Lösung befüllen und dann die Pipette mit der Spritze befüllen. Halten Sie beim Entfernen der Spritze leichten Druck auf den Kolben, damit ein Vakuum die Lösung nicht aus der Injektionsrode entfernt. Prüfen Sie, ob Flüssigkeit an möglichen Leckstellen austritt. Tupfen Sie überschüssige Flüssigkeit ab und prüfen Sie erneut auf Undichtigkeiten.

Befestigen Sie nun die Mikrospritze mit Mineralöl an der Injektionsrode. Wischen Sie dann überschüssige Lösung mit Gaze ab. Überprüfen Sie die Injektionsspitze. Es sollte möglich sein, kleine Tropfen Lösung hindurchfließen zu lassen. Andernfalls ist es verstopft oder undicht. Montieren Sie nun die Injektrode sicher an einem Mikropumpensystem. Verschieben Sie dann die Position der Injektionsrode auf die Zielkoordinaten und senken Sie die Elektrode auf den Colliculus superior ab, der durch die Aufzeichnung visuell evozierter Potentiale identifiziert werden kann.

Während die Elektrode abgesenkt ist, üben Sie einen kleinen Überdruck aus, indem Sie eine niedrige Injektionsrate anwenden, um ein Verstopfen zu vermeiden. Unterbrechen Sie die Injektion, wenn die Struktur erreicht ist. Nach dem Einführen der Injektionsrode den freiliegenden Kortex mit warmem Agar bedecken, um ein Austrocknen zu verhindern.

Warten Sie nach dem endgültigen Platzieren der Elektrode 30 Minuten, um die Stabilisierung des die Elektrode umgebenden Gewebes zu ermöglichen. Injizieren Sie dann 400 bis 800 Nanoliter Lösung mit einer Geschwindigkeit von 40 Nanolitern pro Minute, bis die neuronale Aktivität im Colliculus superior inaktiviert ist. Die Elektrode sollte während der Injektion der Hemmlösung eine Verringerung der Spikes aufweisen.