JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 3:06 Min. • August 7th, 2025
Nehmen Sie ein Mikrozentrifugenröhrchen, das den Nervenwachstumsfaktor (NGF), ein neurotrophes Protein, und Protamin, ein positiv geladenes Trägerprotein, enthält.
Protamin-Komplexe mit NGF über elektrostatische Wechselwirkungen, die die Verkapselung erleichtern und den Abbau verhindern.
Geben Sie in ein Glasfläschchen Ethanol, das Lipidhilfsstoffe enthält, die die Lipidzusammensetzung von Lipoproteinen hoher Dichte oder HDL für die Bildung von Nanopartikeln nachahmen.
Mischen Sie es mit zusätzlichem Ethanol für eine gleichmäßige Dispersion. Verdampfen Sie Ethanol unter Stickstoff, um einen dünnen Lipidfilm zu bilden.
Fügen Sie Reinstwasser hinzu und homogenisieren Sie es mit hoher Geschwindigkeit, um die Selbstorganisation zu HDL-ähnlichen Prototyp-Nanopartikeln zu ermöglichen.
Geben Sie den NGF-Protamin-Komplex in die Nanopartikel und inkubieren Sie unter Rühren, um die Verkapselung von NGF-Protamin zu fördern und gleichzeitig ihre Bioaktivität zu erhalten.
Kühlen Sie die Suspension für die Stabilisierung der Nanopartikel ab, fügen Sie dann Apolipoprotein A-I, das primäre Strukturprotein von HDL, hinzu und rühren Sie weiter, um das Protein in die Nanopartikelstruktur zu integrieren.
Diese NGF-beladenen HDL-imitierenden Nanopartikel sind nun bereit für weitere Studien.
Mischen Sie zunächst 10 Mikroliter NGF mit 10 Mikrolitern Protamin USP in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und lassen Sie es 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen, um den Komplex zu bilden. Geben Sie als nächstes 59 Mikroliter Phosphatidylcholin und 11 Mikroliter Sphingomyelin in ein Glasfläschchen.
Fügen Sie außerdem 4 Mikroliter Phosphatidylserin, 15 Mikroliter Cholesterinoleat und 45 Mikroliter Tocopherylpolyethylenglykolsuccinat hinzu. Mischen und verdampfen Sie das Ethanol unter einem sanften Stickstoffstrom für etwa fünf Minuten. Alle sonstigen Bestandteile sollten einen öligen, dünnen Film am Boden des Glasfläschchens bilden.
Geben Sie 1 Milliliter Reinstwasser in das Fläschchen und homogenisieren Sie es 5 Minuten lang bei 9.500 U/min bei Raumtemperatur, um die Prototyp-Nanopartikel oder NPs zu bilden. Geben Sie dann den vorbereiteten Komplex zu den Prototyp-NPs. Inkubieren Sie die Suspension 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius unter Rühren, indem Sie einen kleinen Rührstab in das Glasfläschchen verwenden.
Die MP durch Rühren bei Raumtemperatur weitere 30 Minuten abkühlen lassen. Nach dem Abkühlen 106 Mikroliter Apolipoprotein A-I hinzufügen und über Nacht bei Raumtemperatur umrühren, um die endgültigen NGF-HDL-ähnlichen NPs zu bilden.