Visualisierung neuronaler und vaskulärer Netzwerke in einem Hühnerembryo

Beginnen Sie mit einem befruchteten Hühnerei mit Fenstern, das einen Embryo im Frühstadium enthält, dessen Neuralrohr auf der Höhe von Somiten eins bis sieben herausgeschnitten wurde.

Entnehmen Sie ein GFP-markiertes Spenderneuralrohr von einem phasenangepassten transgenen Hühnerembryo und implantieren Sie es in die Empfängerin, um die richtige anatomische Ausrichtung zu gewährleisten.

Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit um das Transplantat, um die Adhäsion zwischen dem Spender- und dem Wirtsgewebe zu verbessern.

Versiegeln Sie das Fenster mit durchsichtigem Klebeband, um Austrocknung und Kontamination zu verhindern.

Inkubieren Sie die Eizelle, bis sich der Embryo in das gewünschte Stadium entwickelt hat.

Entfernen Sie das Klebeband.

Identifizieren Sie eine Vitellinvene am Eigelb, die Blut zum Embryo transportiert, und entfernen Sie die darüber liegende Vitellinmembran

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Injizieren Sie mit einer Glasnadel stetig einen lipophilen Fluoreszenzfarbstoff in die Vene.

Visualisieren Sie den Embryo unter einem Stereofluoreszenzmikroskop

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Der injizierte Farbstoff bindet an die Endothelzellen, die die Blutgefäße auskleiden, und hebt das Gefäßnetzwerk hervor, während das GFP-markierte Neuralrohr die Verfolgung des neuronalen Netzwerks ermöglicht.

Wenn Sie bereit sind, mit der Transplantation zu beginnen, übertragen Sie das präparierte Neuralrohr vorsichtig vom Uhrglas auf den Wirtsembryo. Positionieren Sie das Neuralrohr in der richtigen Ausrichtung. Und schieben Sie das Explantat vorsichtig angrenzend in den herausgeschnittenen Bereich. Verwenden Sie bei Bedarf das Mikroskalpell, um das Explantat auf die genaue Größe der exzidierten Region zu trimmen.

Sobald Sie sich in der richtigen Position befinden, entfernen Sie PBS und andere Flüssigkeiten, um dem Spender- und Wirtsgewebe zu helfen, zu haften und das Transplantat zu etablieren. Die erfolgreiche Integration des transplantierten GFP-positiven Neuralrohrs in den Wildtyp-Wirt des Huhns kann unter einem Fluoreszenzmikroskop beurteilt werden. Versiegeln Sie das gesamte Fenster mit 24 Millimeter breitem, durchsichtigem Klebeband, um Austrocknung und Kontamination zu verhindern.

Beschriften Sie den chimären Embryo. Und geben Sie das Ei zur weiteren Entwicklung in den Brutkasten zurück.

Entnehmen Sie das Ei zum gewünschten Versuchszeitpunkt aus dem Brutkasten. Und entfernen Sie das durchsichtige Klebeband, um Zugang zum Embryo zu erhalten. Sobald sie sichtbar ist, lokalisieren Sie eine zugängliche Vene am Eigelb und stellen Sie sicher, dass der Blutfluss zum Embryo geleitet wird.

Wählen Sie als Injektionsstelle einen Verzweigungspunkt an einer der Vitellinvenen. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Vitellinmembran über dem gewählten Injektionspunkt zu entfernen, indem Sie sie in entgegengesetzte Richtungen reißen. Passen Sie als Nächstes den Durchmesser einer gezogenen Glasnadel an die Größe der Vene an.

Beladen Sie die Nadel mit 5 bis 10 Mikrolitern DiI-Lösung. Führen Sie die Nadel schnell in die Vene ein. Und blasen Sie gleichmäßig mit dem Mundschlauch, damit der DiI langsam in den Blutfluss einsteigen kann, ohne ein Gerinnsel zu bilden. Der Erfolg der DiI-Injektion kann durch eine kurze Betrachtung des Embryos unter einem Fluoreszenzmikroskop beurteilt werden.