Echtzeit-In-vitro-Bildgebung der axonalen Verzweigung in kortikalen Neuronen der Maus

0 Ansichten3:21 Min. • June 17th, 2025

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Nehmen Sie eine Bildgebungsschale mit Glasboden, die embryonale kortikale Neuronen der Maus enthält.

Platzieren Sie die Schale in der Klimakammer eines DIC-Mikroskops, um die Lebensfähigkeit der Zellen während der Bildgebung zu erhalten.

Die DIC-Mikroskopie teilt polarisiertes Licht in zwei Strahlen auf, die die Probe durchqueren.

Schwankungen des Brechungsindex über die Probe führen zu Phasenverschiebungen zwischen diesen Strahlen.

Wenn die Strahlen rekombinieren, erzeugen ihre Interferenzen ein kontrastreiches Bild, das feinere Zellstrukturen sichtbar macht.

Identifizieren Sie Neuronen mit unverzweigten Axonen und verwenden Sie Zeitraffer-Bildgebung, um axonale Verzweigungen zu visualisieren.

Behandeln Sie mit Netrin-1, einem extrazellulären Leitsignal, der an axonale Rezeptoren bindet und eine lokalisierte Exozytose auslöst.

Exozytäre Vesikel liefern Membrankomponenten an die Stellen, während das Zytoskelett reorganisiert wird, um die Membranexpansion zu unterstützen.

Unter dem Mikroskop erscheinen diese Veränderungen als kleine Vorsprünge, die den Beginn der axonalen Verzweigung markieren.

Im Laufe der Zeit entwickeln sich diese Vorsprünge zu reifen axonalen Ästen, die den dynamischen Prozess der neuronalen Entwicklung veranschaulichen.

Nach zwei Tagen in vitro stellen Sie die Bildgebungsschale mit Glasboden mit untransfizierten Neuronen in eine vorgewärmte, feuchte Klimakammer. Verwenden Sie ein Mikroskop, das mit einem 60-fachen Planapochromaten, einem 1,4-NA-DIC-Objektiv und einem Kondensor mit hoher numerischer Apertur ausgestattet ist, um die beste Bildqualität und Auflösung zu erzielen. Stellen Sie dann bei Durchlichtbeleuchtung die Fokusebene so ein, dass Neuronen durch das Okular gefunden werden.

Für die DIC-Bildgebung von Axonverzweigungen ist die richtige Einstellung der kühleren Beleuchtung ein wesentlicher Bestandteil der Bildoptimierung und entscheidend für die Erzielung analysierbarer Ergebnisse. Wenn sich die interessierenden Neuronen im Sichtfeld befinden, verwenden Sie dann die Mehrbereichserfassungsfunktion in der Bildgebungssoftware, um die XYZ-Positionen von mindestens sechs Zellen zu finden und zu speichern. Fügen Sie nun zu einer Endkonzentration von 250 Nanogramm pro Milliliter Netrin-1 oder einen anderen Faktor von Interesse hinzu, um die Zellen zu stimulieren, und drücken Sie auf Mehrbereichserfassung starten.

Nehmen Sie 24 Stunden lang nacheinander Bilder an jeder Position alle 20 Sekunden auf, unterbrechen Sie die Aufnahme und fokussieren Sie bei Bedarf neu. Überprüfen Sie in der Imaging-Software Bilder, indem Sie App, Multidimensionale Daten überprüfen auswählen und die gewünschte Datei öffnen. Identifizieren Sie stabile Axonäste, die sich während der Bildgebungssitzung bilden. Verwenden Sie das Werkzeug für den Spurbereich, um einen stabilen Axonzweig von der Basis des Axons bis zur Spitze zu messen.

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Zuletzt aktualisiert: 1 August 2026