Bildgebung von schnellen Kalziumtransienten in Nervenenden von Mäusen mittels konfokaler Mikroskopie

Beginnen Sie mit einer mit Silikonelastomer beschichteten Versuchskammer, in der sich ein gesicherter Mausmuskel befindet, der unter einem konfokalen Mikroskop positioniert ist.

Der Muskel wird in eine physiologische Lösung getaucht, die Inhibitoren enthält, die die Muskelkontraktionen blockieren.

Der mit einem fluoreszierenden Kalziumfarbstoff markierte Nervenstumpf befindet sich im Inneren der Saugelektrode, die mit einem elektrischen Stimulator verbunden ist.

An der neuromuskulären Verbindung ist der periphere Nerv mit dem Muskel verbunden.

Üben Sie mit der Elektrode einen elektrischen Reiz auf den Nerv aus. Dies löst einen schnellen Einstrom von Kalziumionen aus, die an intrazellulären Kalziumfarbstoff binden

Beleuchten Sie die neuromuskuläre Verbindung, um den Kalziumfarbstoff anzuregen, wodurch er fluoresziert.

Nehmen Sie dann hochauflösende Bilder auf, um schnelle Kalziumtransienten in den peripheren Nervenenden aufzuzeichnen.

Wählen Sie den interessierenden Bereich aus und messen Sie die Fluoreszenzintensität.

Ein rascher Anstieg der Fluoreszenzintensität deutet auf einen Kalziumeinstrom an den peripheren Nervenenden hin, während eine Abnahme die Kalziumclearance widerspiegelt.

Füllen Sie das Perfusionssystem mit der Ringer-Lösung, die 10 mikromolare D-Tubocurarin enthält, und schalten Sie die Perfusionssaugpumpe ein, um die Perfusion zu starten. Wählen Sie in der Software Laser Scanning Confocal Microscope (LSCM) die Elektrophysiologie und den Aufnahmemodus aus, um die Bildgebungsparameter einzustellen. Wählen Sie in den Einstellungen des Job-Menüs die Trigger-Einstellungen, um den Stimulator mit dem Mikroskop-Synchronisationsimpuls zu triggern, und stellen Sie den Trigger Out on Frame Field auf den Kanal OUT 1 ein.

Schalten Sie den Scanmodus bei einer Scanfrequenz von 1.400 Hertz auf xyt. Der Zoomfaktor sollte 6,1 betragen, wenn die Lochblende vollständig geöffnet ist. Stellen Sie sicher, dass der bidirektionale x-Modus für sequenzielles Transpassing aktiviert ist. Legen Sie dann die Mindestzeit für die Bildung eines Frames auf 52 Millisekunden fest und erfassen Sie Frames in einem Rohvideo mit 20 Frames. Stellen Sie die Anregungswellenlänge des Argonlasers auf 488 Nanometer mit 8 % der Ausgangsleistung ein.

Wenn die Parameter eingestellt sind, drücken Sie die Live-Modus-Taste, um eine Live-Vorschau der mit dem Farbstoff geladenen Nervenenden zu erhalten. Suchen Sie im Live-Modus nach dem Region Of Interest (ROI), um den besten Fokus zu erzielen, und verschieben Sie dann die Verzögerung auf dem Stimulator um 2 Millisekunden im Vergleich zum vorherigen Wert. Und führen Sie die Datenerfassungssoftware aus, um 26 Sequenzen zu erfassen, indem Sie jede Sequenz um zwei Millisekunden von der vorherigen verschieben.