Teratom-Generation in den Hoden Capsule

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Pluripotenz zu testen, indem Teratome in der Tunica albuginea von immundefizienten Mäusen mit menschlichen pluripotenten Stammzellen oder H PSCs erzeugt werden. Beginnen Sie damit, eine Kultur der zu testenden potenziellen H PSCs zu gewinnen. Führen Sie anschließend eine Operation durch, um die Maushoden freizulegen, und injizieren Sie die Zellen in die Hodenkapsel.

Bringen Sie die Hoden nach sechs bis zwölf Wochen an ihren ursprünglichen Ort zurück und verschließen Sie den Rücken der Maus chirurgisch. Untersuchen Sie den entstandenen Tumor histologisch auf das Vorhandensein von Zellen aus jeder Keimblattschicht. Letztendlich können Ergebnisse belegen, dass eine HPSC-Linie tatsächlich pluripotent ist, indem gezeigt wird, dass sie sich in einer immungeschwächten Maus in Zellen aller drei Keimblätter differenzieren kann. Obwohl kürzlich neue Methoden zur Nachweis der Pluripotenz menschlicher Stammzellen beschrieben wurden, bleibt der Teratoma-Assay der Goldstandard in diesem Bereich. Die Darstellung des Verfahrens wird von Tron, einer leitenden Technikerin in meinem Labor, durchgeführt.

Bringen Sie die menschlichen pluripotenten Stammzellen bis zur Konfluenz und dissociieren Sie anschließend die HPSEs mit Accutase. Zählen Sie die Zellen und resuspendieren Sie 1 Million HPCs pro Injektion. Rasieren Sie zunächst den Bauch von sechs Wochen alten männlichen Mäusen einer immundefizienten Mauslinie unter Narkose mit einem Schermesser. Reinigen Sie die vordere Bauchwand der Maus mit Povidon-Iod-Lösung, beginnend in der Mitte des Bauches und sich im Uhrzeigersinn nach außen bewegend.

Anschließend wird der rasierte Bereich dreimal mit 70 % Ethanol abgewischt, wobei jedes Mal ein neuer Tupfer verwendet wird. Zum Durchführen des chirurgischen Eingriffs wird das Tier in eine sterile Haube auf eine Heizplatte überführt, wobei sterile chirurgische Scheren verwendet werden.

Führen Sie einen ein Zentimeter langen Längsschnitt durch die Haut und das Peritoneum direkt unterhalb des Hüftgelenks durch, wobei Sie das Peritoneum mit einer Pinzette festhalten. Greifen Sie mit einem weiteren Paar steriler Pinzetten in Richtung des rechten Hüftgelenks und ziehen Sie das weiße Fettgewebe zusammen mit den daran befestigten Hoden heraus. Befüllen Sie nun eine Ein-Kubikzentimeter-Tuberkulinspritze mit den zu injizierenden hPSCs und injizieren Sie langsam 20 bis 30 Mikroliter H-PSCs in die Mitte der Hodenkapsel, fernab von größeren Blutgefäßen.

Entfernen Sie die Nadel langsam mit einer Pinzette, um einen Rückfluss der Zellen zu vermeiden. Bringen Sie die Hoden und das Fettgewebe wieder in ihre ursprüngliche Position im Bauchraum zurück. Schließen Sie das Peritoneum mit zwei oder drei resorbierbaren Nähten und die Haut mit Autoklammern.

Nach der Operation Analgetika nach Bedarf zweimal täglich verabreichen. Das Tier über einen Zeitraum von sechs bis zwölf Wochen auf tastbare Tumorentwicklung überwachen. Bei einer Tumorgröße von etwa fünf Millimetern den Tumor von der getöteten Maus entfernen, um ihn zu dokumentieren.

Fotografieren Sie den Tumor und messen Sie Größe und Gewicht. Anschließend schneiden Sie den Tumor in kleine Stücke und fixieren ihn zur histopathologischen Untersuchung in einer 4%igen Paraldehydlösung. Typischerweise wird nach sechs bis zwölf Wochen ein Teratom beobachtet.

In diesem Beispiel wurden eine Million menschliche WA oh nine pluripotente Stammzellen in die Tunica albuginea eines immundefizienten Mäuses injiziert. Eine genaue Untersuchung des Teratoms zeigt Heterogenität und zahlreiche angeheftete Zysten. Wie erwartet.

Die histopathologischen Analysen weisen Zellen aus allen drei Keimblättern nach. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, eine positiv kontrollierte Zelllinie einzuschließen, von der bekannt ist, dass sie ziemlich potent ist, um sicherzustellen, dass der Test korrekt durchgeführt wurde. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine klare Vorstellung davon haben, wie man bestimmt, ob eine humane Stammzelllinie pluripotent ist oder nicht.