$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
MOGtag ist ein rekombinantes Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein, das mit Solubilisierungs- und Reinigungsmarkierungen für experimentelle Studien zur Autoimmunenzephalomyelitis fusioniert ist.
Um MOGtag zu isolieren, suspendieren Sie Bakterienzellen, die MOGtag exprimieren, in einem Lysepuffer und inkubieren Sie.
Enzyme und Detergenzien im Puffer stören die Membranlipide und bauen die Zellwand ab.
Beschallung, um die Zellen weiter zu lysieren und unlösliche Einschlusskörper freizusetzen, die MOGtag enthalten.
Zentrifugieren Sie, um die Einschlusskörper zu pelletieren. Entsorgen Sie den Überstand, suspendieren Sie das Pellet wieder im Puffer und inkubieren Sie.
Fügen Sie Guanidinhydrochlorid hinzu und inkubieren Sie, um MOGtag zu lösen.
Übertragen Sie die löslichen Proteine auf ein geladenes Nickelharz, mischen Sie sie und inkubieren Sie sie durch Schütteln, damit MOGtag an die Nickelionen binden kann.
Zentrifugieren Sie, um den gebundenen MOGtag zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand, suspendieren Sie das Pellet in einem Elutionspuffer und inkubieren Sie es unter Schütteln.
Imidazol im Elutionspuffer setzt MOGtag aus dem Harz frei.
Zentrifugieren Sie erneut, sammeln Sie den gereinigten MOGtag-haltigen Überstand und lagern Sie ihn für die weitere Analyse.
Verteilen Sie die Kulturen gleichmäßig auf 250-Milliliter-Flaschen, die mit der Hochgeschwindigkeitszentrifugation kompatibel sind, und halten Sie die Flaschen von diesem Zeitpunkt an auf Eis. Pelletieren Sie die Bakterienzellen bei 22.000 * g für 15 Minuten bei 4 Grad Celsius. Resuspendieren und kombinieren Sie alle Bakterienpellets in insgesamt 30 Millilitern Lysepuffer. Übertragen Sie dieses Volumen in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden, das für eine Hochgeschwindigkeitszentrifugation geeignet ist.
Legen Sie diese Röhre für 30 Minuten in ein 30 Grad Celsius heißes Wasserbad. Schütteln Sie das Röhrchen während der Inkubationszeit zweimal, um die Zellen wieder zu suspendieren. Nach der Inkubation wird das Röhrchen auf Eis übertragen und die Lösung bei 20 Kilohertz und einer Amplitude von 70 % beschallt, wobei es drei Sekunden lang ein- und drei Sekunden lang für 5 Impulse ausgeschaltet wird. Beschallen Sie die Lösung für insgesamt sechs Runden mit je fünf Impulsen, so dass die Lösung zwischen den Runden auf dem Eis abkühlen kann.
Als nächstes zentrifugieren Sie die Lösung bei 24.000 * g für 15 Minuten bei 4 Grad Celsius, suspendieren Sie dann das Pellet in 30 Millilitern Puffer A und inkubieren Sie die Lösung drei Stunden lang bei 4 Grad Celsius. Geben Sie dann 17,2 Gramm Guanidin-HCl in die Lösung. Inkubieren Sie die Probe eine Stunde lang auf Eis, um das MOG-Tag-Protein zu lösen. Um das MOG-Tag-Protein zu reinigen, übertragen Sie das gesamte Volumen des löslichen Proteins in das erste Röhrchen mit dem Nickelharz. Stellen Sie das Röhrchen nach dem Mischen eine Stunde lang bei 4 Grad Celsius waagerecht auf eine Wippe.
Nachdem Sie das Röhrchen acht Minuten lang bei 4.500 * g bei 4 Grad Celsius zentrifugiert haben, überführen Sie den Überstand in das zweite Röhrchen mit Nickelharz und inkubieren Sie wie zuvor. In der Zwischenzeit das Nickelharz im ersten Röhrchen in 40 Milliliter Elutionspuffer resuspendieren und das Röhrchen fünf Minuten lang waagerecht bei 4 Grad Celsius auf eine Wippe stellen, bevor es wie bisher zentrifugiert wird. Der Überstand, der das eluierte MOG-Tag-Protein enthält, wird in eine 250-Milliliter-Flasche mit der Aufschrift "gereinigtes MOG-Tag-Protein" überführt. Bewahren Sie diese Flasche bei 4 Grad Celsius auf.