Elektroporations-vermittelte Transfektion von Spinalganglien der Maus zur Förderung der revitalisierten Axon

Nehmen Sie eine anästhesierte Maus mit freiliegenden L4- und L5-Spinalwurzelganglien, die sensorische Neuronenzellkörper enthalten.

Bestücken Sie eine Mikroinjektionspipette mit Fluorophor-markierten RNA-Konstrukten, die die Axonregeneration regulieren, und einem Tracerfarbstoff.

Das Gemisch in die DRGs injizieren.

Wenden Sie mit Elektroporationselektroden elektrische Impulse an die DRGs an.

Dadurch werden die Membranen der sensorischen Neuronenzellkörper gestört und Poren geschaffen, die es den Konstrukten ermöglichen, in das Zytoplasma einzudringen und die Transfektion zu erleichtern.

Nähen Sie den Schnitt und lassen Sie die Maus sich erholen.

Betäuben Sie die Maus nach einigen Tagen erneut und sichern Sie sie.

Machen Sie einen Schnitt lateral der Mittellinie auf der linken Seite. Präpariere die Muskeln, um den Ischiasnerv freizulegen.

Zerquetschen Sie den Nerv, um sensorische Neuronenaxone zu verletzen. Markieren Sie die Stelle mit einem Nahtknoten.

Nähen Sie den Schnitt und lassen Sie die Maus sich erholen.

Die transfizierten Konstrukte zielen auf mRNAs in den sensorischen Neuronenzellkörpern der DRG ab und modulieren vorübergehend die Proteinproduktion, um die regeneration der sensorischen Axone nach einer Verletzung zu verbessern.

Für die DRG-Injektion laden Sie die DNA-Plasmide oder RNA-Oligos in die Glaskapillarpipette. Führen Sie dann die Spitze der Kapillarglaspipette vorsichtig in die DRG ein. Injizieren Sie nach und nach 1 Mikroliter Lösung von DNA-Plasmiden oder RNA-Oligos mit dem intrazellulären Mikroinjektions-Dispense-System.

Für die Elektroporation kneifen Sie das Ziel-DRG vorsichtig mit den Elektroden zusammen und legen Sie mit dem Elektroporationssystem elektrische 5-Quadrat-Impulse an. Anschließend verschließen Sie den Muskel und dann die Hautschichten mit Nylonnähten. Zwei oder drei Tage nach der DRG-Elektroporation betäuben Sie die Maus intraperitoneal, kleben Sie ihre Gliedmaßen auf die Korkplatte und machen Sie einen 1-Zentimeter-Schnitt 0,5 Zentimeter nach links entlang der Mittellinie.

Schneiden Sie anschließend die Muskeln, wie z. B. den Musculus gluteus maximus und den Musculus piriformis, in Längsrichtung ab. Legen Sie dann das Segment des Ischiasnervs zwischen dem Foramen ischiasis major und der Ischiaskerbe frei. Quetschen Sie den Nerv 12 Sekunden lang mit einer mikrochirurgischen Pinzette und markieren Sie die Quetschstelle mit einer epineuralen Nylonnaht. Anschließend verschließen Sie die Muskel- und Hautschichten mit Nylonnaht.