Quantifizierung dendritischer Dornen mittels konfokaler Mikroskopie

Nehmen Sie pyramidale Neuronen, die transduziert und immunmarkiert sind, um grün zu fluoreszieren.

Erfassen Sie Bilder der Neuronen mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit angepassten Einstellungen, um eine optimale Bildqualität zu gewährleisten.

Öffnen Sie ein Bild mit einer speziellen Software und verwenden Sie den Gaußschen Filter, um das Hintergrundrauschen zu reduzieren.

Führen Sie eine halbautomatische Dendritenverfolgung durch, indem Sie zuerst den Dendritendurchmesser schätzen. Wählen Sie dann den Startpunkt, den Pfad und den Endpunkt des Dendriten aus.

Für eine automatische Segmentierung der Wirbelsäule wählen Sie Dendritendurchmesser neu aufbauen und legen Sie den Schwellenwert für das Dendritenvolumen fest, um das tatsächliche Dendritenvolumen darzustellen.

Geben Sie Werte für den kleinsten Durchmesser des Wirbelsäulenkopfes und die maximale Länge des Rückens an.

Passen Sie den Schwellenwert für Punkte an, die Spines darstellen, und stellen Sie sicher, dass sie auf tatsächlichen Spine-Köpfen lokalisiert sind.

Legen Sie Parameter fest, um die Stacheln basierend auf Länge, Kopfdurchmesser und Form zu klassifizieren.

Generieren Sie ein 3D-Modell des Dendriten mit Stacheln und exportieren Sie die Daten zur weiteren Analyse.

Wählen Sie unter einem konfokalen Mikroskop mindestens 10 gesunde Neuronen pro Zustand mit einer pyramidalen Morphologie und einer vollständigen dendritischen Arborisation aus. Um 60 bis 100 Mikrometer pro Dendrit zu quantifizieren, nehmen Sie Bilder mit einem 40x-Ölobjektiv NA 1.3 und einem 488-Nanometer-Laser mit einer typischen Spitzenleistung auf Probenebene von etwa 20 Mikrowatt auf.

Stellen Sie die Pixelgröße auf etwa 80 Nanometer ein, um die dendritischen Stacheln richtig abzutasten. Um das gesamte Neuronenvolumen abzutasten, erfassen Sie einen Z-Stapel mit einem Z-Abstand von 150 bis 300 Nanometern, was 20 bis 30 Z-Schichten ergibt. Um eine 3D-Quantifizierung von dendritischen Dornen durchzuführen, verwenden Sie die folgenden Einstellungen für die Analysesoftware.

Verwenden Sie für die Vorverarbeitung die Gaußsche Filterung, indem Sie Bildverarbeitung, Glättung, Gaußscher Filter auswählen. Legen Sie die Filterbreite auf die Pixelgröße in der XY-Ebene fest. Um eine halbautomatische Verfolgung von Dendriten durchzuführen, verwenden Sie über das Filament-Tracer-Modul auf der Registerkarte Slice das Abstandswerkzeug, um den Dendritendurchmesser zu schätzen.

Klicken Sie anschließend auf der Registerkarte "Surpass" auf das Werkzeug "Filamente" und wählen Sie "Automatische Erstellung überspringen", um die Robustheit zu verbessern. Wählen Sie auf der Registerkarte Zeichnen die Option AutoPath als Methode und Dendrit als Typ aus, und geben Sie den geschätzten Dendritendurchmesser ein. Verwandeln Sie den Cursor im Auswahlmodus des Zeigers in ein Feld, wählen Sie die Umschalttaste und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Dendritenstartpunkt. Die Software führt erste Berechnungen durch.

Bewegen Sie nun den Mauszeiger entlang des Dendriten. Vom Startpunkt aus ist eine gelbe Linie dargestellt, die den wahrscheinlichsten Dendritenweg darstellt. Drücken Sie die Umschalttaste und klicken Sie mit der linken Maustaste auf den Dendritenendpunkt. Um eine automatische Segmentierung der Wirbelsäule durchzuführen, klicken Sie in der Moduloberfläche auf die Registerkarte Erstellung. Wählen Sie in der Dropdown-Liste "Wiederherstellung" die Option "Dendritendurchmesser neu erstellen" aus und aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Daten beibehalten". Klicken Sie dann auf Neu erstellen.

Stellen Sie den Schwellenwert so ein, dass das segmentierte Volumen dem tatsächlichen Dendritenvolumen entspricht. Wählen Sie als Algorithmus die kürzeste Entfernung aus der Entfernungskarte aus. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Weiter. Bestimmen Sie auf der Registerkarte Slice den kleinsten Durchmesser des Wirbelsäulenkopfes und die maximale Länge.

Geben Sie dann auf der Registerkarte Surpass die Parameter ein. Werte um 200 bis 300 Nanometer für den minimalen Durchmesser und 4 Mikrometer für die maximale Länge sind gute Ausgangspunkte. Wenn Sie das Kontrollkästchen Spines zulassen nicht aktivieren, klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter.

Passen Sie als Nächstes den Schwellenwert für Kernpunkte so an, dass die blauen Punkte, die die Spines darstellen, an den tatsächlichen Spine-Köpfen lokalisiert werden. Klicken Sie dann auf Weiter. Die Kernberechnung wird nun durchgeführt und kann einige Zeit in Anspruch nehmen. Um Spines zu klassifizieren, klicken Sie auf der Registerkarte Tools der Moduloberfläche auf Spines klassifizieren.

Nachdem überprüft wurde, ob es vier Klassen gibt, wie im Textprotokoll beschrieben, generiert die Modulschnittstelle vier neue Filamentobjekte mit den Ergebnissen der Klassifizierung. Exportieren Sie abschließend die statistischen Daten auf der Registerkarte Statistiken, indem Sie auf Alle Statistiken in Datei exportieren klicken.