Flash-Photolyse von Caged Compounds in den Zilien der Riechzellen
October 29th, 2011
Photolyse von caged-Verbindungen ermöglicht die Produktion von schnellen und lokalisierten Anstieg der Konzentration von verschiedenen physiologisch aktiven Verbindungen. Hier zeigen wir, wie Patch-Clamp-Aufnahmen mit der Photolyse von caged cAMP kombiniert oder caged Ca für das Studium der olfaktorischen Wahrnehmung in dissoziierten Maus Riechzellen erhalten.
Unser Geruchssinn ermöglicht es uns, flüchtige Chemikalien in der äußeren Umgebung zu erkennen und zu erkennen. Ance binden an Rezeptoren in der Stadt der olfaktorischen sensorischen Neuronen und aktivieren eine Transduktionskaskade, die zur Öffnung von zyklischen Nukleotid-gesteuerten Kanälen führt, gefolgt von Kalziumaktivator-Chloridkanälen. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu zeigen, wie diese Kanäle direkt durch Fleisch aktiviert werden können. Foto von Käfigverbindungen, Käfigverbindungen sind Moleküle, die durch einen chemischen Käfig physiologisch inaktiv gemacht werden.
Ein Fleisch aus ultraviolettem Licht zerbricht einen Käfig und setzt die physiologisch aktiven Verbindungskäfige frei. Cycl-, mp- oder Cage-Calcium sind in der intrazellulären Lösung enthalten, füllen ein Pflaster, pipettieren und diffundieren zum C der olfaktorischen sensorischen Neuronen. Ein Ultrablitz wird auf den Cary-Bereich angelegt, um einen Zyklus, MP oder Kalzium zu aktivieren, während Patch-Clamp-Aufzeichnungen zur Messung des Stroms und in der gesamten Zellenspannungsklemmenkonfiguration gemacht werden.
Hi.Today zeigen wir Ihnen ein Verfahren für Patch-Clamp-Aufnahmen in Kombination mit FE-Richtlinien von Käfigverbindungen. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um CMP-gesteuerte Kanäle und Kalzium-aktivierte Cholinkanäle in olfaktorischen Sensorneuronen zu untersuchen. Also lasst uns loslegen.
Das hier verwendete Patch-Clamp-Aufzeichnungssystem umfasst ein inverses Mikroskop, ein Perfusionssystem, einen Mikromanipulator, eine Aufzeichnungselektrode und die Referenzelektrode, die mit dem Kopftisch des Patch-Clamp-Verstärkers verbunden sind, die alle auf einem Anti-Vibrationstisch in einem Faradayschen Käfig montiert sind. Der Patch-Clamp-Verstärker wird mit einem Digitizer im Computer mit Software zur Datenerfassung verbunden. Um einen Blitz mit ultraviolettem Licht mit hoher Intensität zu erzeugen, verwenden wir die Excelon-Blitzlampe.
Der Lichtblitz kann manuell oder vom Computer mit derselben Software ausgelöst werden, die auch die elektrophysiologische Erfassung steuert. Die besten Wellenlängen für Fotoexperimente werden durch Einsetzen eines UV-Filters in einen Ausgangsschlitz oder die Blitzlampe ausgewählt. Die Intensität des Lichtblitzes kann durch Ändern der Spannung oder der Kapazität der Fleischlampe verändert werden.
Eine genauere Steuerung der Lichtintensität wird erreicht, indem Neutraldichtefilter in einem zweiten Ausgangsschlitz der Fleischlampe platziert werden. Der Lichtblitz wird durch einen optischen Lichtleiter aus Quarzfaser auf das Neuron gerichtet, das auf Glasbodenschalen plattiert ist. Der Lichtleiter wird mit dem Epi-Fluoreszenz-Aufsatz des inversen Mikroskops verbunden.
Ein modifizierter Filterwürfel ohne Anregungsfilter lenkt mit Hilfe eines Adapters einen UV-Bin per Spiegel auf das Neuron. Das Licht wird durch ein 100-faches Ölimmersionsobjektiv gebündelt. Der vom Fleisch bedeckte Bereich wird visualisiert, indem der Lichtleiter in einen Illuminator eingeführt wird.
Das Bild wird über eine CCD-Kamera, die mit dem Mikroskop verbunden ist, auf einem Monitor betrachtet. Die Kontrolle des Bereichs wird auf dem Monitor eingezeichnet, um den UV-Fleischbereich für die Experimente zu lokalisieren, bevor die Dissektion erfolgt, drei Glasbodenschalen vorbereiten, die mit Conna A und Poly beschichtet sind. Zur Vorbereitung der Sektion füllen Sie zwei 50 Millimeter überzogene Petrischalen mit Ringerlösung.
Lege sie auf Eis. Auch chillen. Ein Papa besteht darauf, 0,5 Milliliter der Stop-Mix-Lösung und die Spritze mit etwa 10 Millilitern Ringerlösung zu mischen.
Beginnen wir mit der geopferten Maus. Entfernen Sie die Haut eines ausgekleideten Schädels, schneiden Sie entlang der Kieferlinien und legen Sie den Kopf in eine silberbeschichtete Petrischale. Legen Sie die Schale mit einem Skalpell sagittal bi unter ein Steroidmikroskop
.Präpariere den Kopf entlang der Mittellinie. Drehen Sie die Hälfte des Kopfes mit der medialen Seite nach oben. Entfernen Sie vorsichtig das Septum, um die Enden freizulegen.
Hier zeigen wir ein vergrößertes Bild beim Entfernen des Septums mit der Pinzette Nummer drei im Skalpell. Entferne vorsichtig die Endverschlüsse, die mit deinem Fettepithel ausgekleidet sind. Mit der superfeinen Pinzette Nummer 55 und dem Skalpell in eine andere silberbeschichtete Petrischale geben.
Trennen Sie Teile des Refactor-Epithels von den zugrunde liegenden Enden. Übertragen Sie die Stücke des olfaktorischen Epithels in ein Röhrchen mit einem Milliliter nullwertiger Ringerlösung. Dann den Papa Instein dazugeben.
Mit einer Mikroschere inkubiert das Epithel bei Raumtemperatur für drei Minuten schonend, d.h. wieder mit einer Mikroschere. Warten Sie weitere fünf Minuten, indem Sie eine flammpolierte Pipette mit großer Bohrung verwenden, übertragen Sie sie fünf Minuten lang in ein Röhrchen mit der Stopplösungszentrifuge und verwerfen Sie den Überstand. Etwa einen Milliliter Filterringerlösung vorsichtig mit einer flammpolierten Pipette mit einer Bohrung von etwa einem Milliliter Durchmesser zugeben.
Geben Sie die Lösung mit den Zellen in die Mitte von drei Gläsern. Bodenschalen ermöglichen es den Zellen, sich etwa eine Stunde lang bei vier Grad Celsius anzusiedeln. Fügen Sie dann Ringerlösung hinzu.
Arbeiten Sie bei schwachem Licht, um die Zersetzung von Käfigverbindungen durch Umgebungslicht zu vermeiden. Tragen Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das 100-fach-Objektiv auf. Stellen Sie eine Glasbodenschale mit den dissoziierten rediosierten sensorischen Neuronen auf den Tisch des inversen Mikroskops.
Mit Ringer-Lösung. Schützen Sie die Spritze mit der intrazellulären Lösung mit Käfigverbindungen mit Aluminiumfolie vor Licht und bewahren Sie sie im Kühlschrank auf. Suchen Sie nach einem isolierten olfaktorischen sensorischen Neuron mit intakter Kliologie.
Verschieben Sie den Tisch des Mikroskops, um den Cary-Bereich innerhalb des auf dem Monitor gezeichneten Bereichs zu positionieren. Um den UV-Blitzbereich zu lokalisieren, füllen Sie ein Patch-Rohr mit intrazellulärer Lösung, die die Käfigverbindung enthält. Setzen Sie die Pipette in die Halterung des Kopftisches des Apache-Klemmverstärkers ein.
Unter Verwendung von Standard-Patch-Clamp-Techniken. Nähern Sie sich dem Somo des Neurons mit einer Patch-Pipette und erhalten Sie ein Giga-Siegel. Erreichen Sie dann den Ganzzellenmodus auf dem Computer.
Starten Sie ein Stimulationsprotokoll und zeichnen Sie die Reaktion auf. Ein typisches Stimulationsprotokoll klemmt die Spannung auf den konstanten Wert und löst die Freisetzung eines UV-Fleisches zur Lyse der Käfigverbindung aus. Nun zeigen wir Ihnen einige repräsentative Aufnahmen, die hier gezeigt werden, ist die Reaktion einer isolierten Maus oder eines fetten sensorischen Neurons auf die Lyse des Käfigzyklus mp.
Der Pfeil oben zeigt den Zeitpunkt der Freisetzung eines UV-Fruchtfleisches an. Der durch Cycl MP aktivierte Strom wurde bei minus 60 Millivolt in einer extrazellulären kalziumarmen Ringerlösung aufgezeichnet. Die ansteigende Phase des Stroms war schnell und wurde durch eine einzige Exponentialfunktion angepasst.
Hier sehen wir eine Aufzeichnung desselben Neurons, das in normaler Ringerlösung gebadet wurde, die ein millimolares Kalzium enthält. Die Anstiegsphase des Stroms und minus 60 Millivolt wurde viel niedriger und mehrphasig. Dies ist auf die Wirkung von Kalzium zurückzuführen, das in die C-Recycling-P-Kanäle gelangt und einen sekundären Chloridstrom aktiviert.
In diesem Beispiel haben wir die Spannung bei plus 60 Millivolt geklemmt. Dies ist eine weitere Möglichkeit, den Einstrom von Kalzium zu reduzieren. Die ansteigende Phase der Reaktion aufgrund des Zyklon-PN-Einschlusses bei plus 60 Millivolt wurde gut durch eine einzelne Exponentialfunktion beschrieben, die auf das Vorhandensein von nur einer Stromkomponente hinweist.
Ein Beispiel für Reaktionen, die durch Photofreisetzung von Kalzium in der Celia erhalten wurden, ist gezeigt: Dieser Strom wird von Chloridionen getragen. Die Spannung betrug minus 50 Millivolt. Reaktionen mit zunehmenden Amplituden wurden durch photografische Freisetzung von Käfigkalzium mit UV-Blitzen zunehmender Intensität induziert.
Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie bei diesem Verfahren von disassoziierten sensorischen Neuronen aus der Fabrik aufzeichnen können. Es ist wichtig, daran zu denken, sehr geduldig zu sein. Vielen Dank fürs Zuschauen Und viel Glück beim Experiment.
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Übersicht
Diese Studie demonstriert die Verwendung der Photolyse von Käfigverbindungen zur Untersuchung der olfaktorischen Transduktion in olfaktorischen sensorischen Neuronen von Mäusen. Durch die Verwendung von Patch-Clamp-Aufnahmen können Forscher die Auswirkungen von Käfig-cAMP und Käfig-Ca auf die neuronale Aktivität beobachten.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaft
- Elektrophysiologie
- Olfaktorische Transduktion
Hintergrund
- Der Geruchssinn ist entscheidend für die Erkennung flüchtiger Chemikalien.
- Olfaktorische sensorische Neuronen spielen eine Schlüsselrolle bei der Transduktion olfaktorischer Signale.
- Käfigverbindungen werden verwendet, um den Zeitpunkt der Freisetzung aktiver Moleküle zu kontrollieren.
- Photolyse ermöglicht eine schnelle Aktivierung von Signalwegen.
Zweck der Studie
- Zur Demonstration der Aktivierung von cycl-Nukleotid-gesteuerten Kanälen.
- Zur Messung der Auswirkungen von Käfig-cAMP und Käfig-Ca auf olfaktorische sensorische Neuronen.
- Zur Verbesserung des Verständnisses der Mechanismen der olfaktorischen Signaltransduktion.
Verwendete Methoden
- Patch-Clamp-Aufnahmen von dissoziierten olfaktorischen sensorischen Neuronen von Mäusen.
- Verwendung von Käfig-cAMP und Käfig-Ca in der intrazellulären Lösung.
- Anwendung von ultraviolettem Licht zur Photolyse von Käfigverbindungen.
- Ganzzell-Spannungsklemmkonfiguration für Strommessung.
Hauptergebnisse
- Eine erfolgreiche Aktivierung von cycl-Nukleotid-gesteuerten Kanälen wurde beobachtet.
- Lokalisierte Erhöhungen der cAMP- und Ca-Konzentrationen wurden erreicht.
- Patch-Clamp-Aufnahmen lieferten Einblicke in neuronale Reaktionen.
- Die Methodik zeigte eine effektive Kontrolle über Signalwege.
Schlussfolgerungen
- Die Photolyse von Käfigverbindungen ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung neuronaler Signalübertragung.
- Dieser Ansatz kann unser Verständnis der olfaktorischen Transduktion verbessern.
- Zukünftige Studien können auf diesen Methoden aufbauen, um andere Signalwege zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Photolysis of caged compounds enables precise temporal and spatial control of intracellular signaling molecules, supporting mechanistic de-risking in early neuroscience target validation. This approach enhances predictive confidence by allowing direct interrogation of cyclic nucleotide-gated and calcium-activated chloride channel function in olfactory sensory neurons. The method provides a translatable platform for assessing ligand-gated ion channel dynamics in disease-relevant neuronal systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct activation of cyclic nucleotide-gated channels to interrogate olfactory transduction mechanisms and validate cAMP-dependent signaling hypotheses.
- Operational Value: Provides localized, rapid increases in cAMP or calcium concentration to isolate specific pathway contributions without confounding secondary effects.
- Predictive Value: Supports target de-risking by confirming functional coupling between receptor activation, second messenger production, and downstream ion channel responses.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Combines photolytic uncaging with patch-clamp electrophysiology to generate quantitative, real-time current measurements as functional readouts.
- Reproducibility: Uses standardized flash lamp parameters and UV filter selection to ensure consistent light intensity and wavelength control across experiments.
- Scalability: Employs quartz fiber optical light guides and inverted microscope systems to deliver precise UV stimulation to dissociated neurons in multi-well compatible formats.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models olfactory sensory neuron dysfunction where cyclic nucleotide-gated or calcium-activated chloride channel activity is altered, supporting mechanistic studies of anosmia-related conditions.
- Translational Continuity: Bridges molecular target engagement (cAMP/Ca²⁺ release) with electrophysiological phenotypes, enabling correlation of biochemical events with functional neuronal output.
- Mechanistic De-risking: Isolates variables such as extracellular calcium concentration to distinguish primary cyclic nucleotide-gated currents from secondary calcium-activated chloride contributions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows by enabling hypothesis-driven validation of ion channel targets prior to lead identification, with outputs informing assay readiness for compound screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports mechanistic interrogation of olfactory transduction pathways by allowing precise temporal control of second messenger release to assess channel gating kinetics and selectivity.
- Screening: Generates electrophysiological readouts (current amplitude, rise time, voltage dependence) that can be used to evaluate compound effects on cyclic nucleotide-gated or calcium-activated chloride channel function.
- Analytics: Provides quantitative current measurements under whole-cell voltage clamp, enabling comparison of photolytically evoked responses across conditions and genotypes.
- Translational Research: Connects second messenger dynamics to neuronal excitability in a disease-relevant sensory neuron model, supporting biomarker-aligned functional validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable photolysis-electrophysiology platform applicable to other caged compounds and neuronal subtypes beyond olfactory systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in olfactory signaling by enabling direct, light-controlled activation of cyclic nucleotide-gated and calcium-activated chloride channels.
- Operational Value: Delivers reproducible, localized uncaging via flash lamp and optical guidance systems, minimizing variability in compound delivery and enhancing data consistency.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence in target validation by providing causal evidence linking second messenger fluctuations to electrophysiological outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated channel function and signaling fidelity in physiologically relevant neuronal preparations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in patch-clamp electrophysiology, photolysis techniques, and olfactory neuronal dissociation.
- Dependent on ultraviolet flash lamp, quartz fiber optical light guide, and inverted microscope with epifluorescence attachment for precise UV delivery.
- Necessitates standardization of intracellular caged compound concentrations and extracellular solution composition to control for calcium-dependent secondary effects.
- Involves adaptation considerations when applying to different neuronal types or subcellular compartments due to variations in caged compound diffusion and UV light penetration.
- Limited by the need for specialized equipment (flash lamp, neutral density filters, UV filters) and careful handling to prevent degradation of caged compounds by ambient light.
