Flash-Photolyse von Caged Compounds in den Zilien der Riechzellen

Unser Geruchssinn ermöglicht es uns, flüchtige Chemikalien in der äußeren Umgebung zu erkennen und zu identifizieren. Anz bindet an Rezeptoren im Bereich der olfaktorischen Sinnesneuronen und aktiviert eine Transduktionskaskade, die zur Öffnung zyklischer nucleotidgesteuerter Kanäle gefolgt von calciumaktivierten Chloridkanälen führt. Das Gesamtziel dieses Verfahrens besteht darin, zu zeigen, wie man diese Kanäle direkt durch Licht aktivieren kann, um „cage“-Verbindungen freizusetzen. „Cage“-Verbindungen sind Moleküle, die durch eine chemische Schutzgruppe physiologisch inaktiv gemacht wurden.

Ein Lichtblitz im ultravioletten Bereich spaltet eine Cagesubstanz und setzt die physiologisch aktive Verbindung frei. Cycl, mp oder cagegebundenes Calcium werden in die intrazelluläre Lösung gegeben, füllen eine Patch-Pipette und diffundieren in das Zellinnere olfaktorischer Sinnesneuronen. Ein ultravioletter Blitz wird auf den Cary-Bereich appliziert, um eine Freisetzung von Cycl, mp oder Calcium auszulösen, während mittels Patch-Clamp-Aufzeichnungen der Strom im Ganzzell-Spannungs-Klemm-Modus gemessen wird.

Hallo. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für Patch-Clamp-Aufnahmen in Kombination mit FE-Pulsen von cagierten Verbindungen. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um cAMP-gesteuerte Kanäle und calciumaktivierte Cholin-Kanäle in olfaktorischen Sinnesneuronen zu untersuchen. Beginnen wir also.

Das hier verwendete Patch-Clamp-Aufzeichnungssystem umfasst ein inverses Mikroskop, ein Perfusionsystem, einen Mikromanipulator, eine Aufzeichnungselektrode und die mit der Kopfstufe des Patch-Clamp-Verstärkers verbundene Referenzelektrode, die alle auf einem vibrationsgedämpften Tisch innerhalb einer Faraday-Kabine montiert sind. Der Patch-Clamp-Verstärker ist über einen Digitalisierer mit einem Computer verbunden, der über Software zur Datenaufnahme verfügt. Um einen intensiven Blitz aus ultraviolettem Licht zu erzeugen, verwenden wir eine Excelon-Blitzlampe.

Der Lichtblitz kann manuell oder über den Computer ausgelöst werden, wobei dieselbe Software verwendet wird, die auch die elektrophysiologische Aufzeichnung steuert. Die optimalen Wellenlängen für die Photoexperimente werden ausgewählt, indem ein UV-Filter in einen Ausgangsschlitz oder die Blitzlampe eingefügt wird. Die Intensität des Lichtblitzes kann geändert werden, indem die Spannung oder die Kapazität der Blitzlampe angepasst wird.

Eine genauere Steuerung der Lichtintensität wird erreicht, indem Neutrale-Dichtefilter in einen zweiten Ausgangsslot der Fleischlampe eingesetzt werden. Der Lichtblitz wird über einen lichtleitenden Quarzfaseroptikschlauch auf das auf Bodengläsern kultivierte Neuron gelenkt. Der Lichtleiter ist mit der Epi-Fluoreszenzvorrichtung des umgekehrten Mikroskops verbunden.

Mithilfe eines Adapters leitet ein modifizierter Filterkasten ohne Anregungsfilter über einen Dichroitspiegel ein UV-Bin zur Neuronenzelle. Das Licht wird durch ein 100x-Ölimmersionsobjektiv fokussiert. Der von der Gewebeprobe bedeckte Bereich wird sichtbar gemacht, indem der Lichtleiter in einen Beleuchter eingeführt wird.

Das Bild wird über eine an das Mikroskop angeschlossene CCD-Kamera auf einem Monitor betrachtet. Der Kontrollbereich wird auf dem Monitor eingezeichnet, um den UV-Bestrahlungsbereich für die Experimente vor der Dissektion zu lokalisieren, und drei mit Conna A und Poly beschichtete Glasbodenkulturschalen vorzubereiten. Zum Vorbereiten der Dissektion zwei mit Zucker beschichtete 50-Millimeter-Petri-Schalen mit Ringer-Lösung füllen.

Stellen Sie sie auf Eis. Kühlen Sie ebenfalls ab. Ein Papa besteht darauf, 0,5 Milliliter der Stop-Mix-Lösung und die Spritze mit etwa 10 Millilitern Ringer-Lösung zu mischen.

Beginnen Sie mit der geopferten Maus. Entfernen Sie die Haut entlang des Schädels, schneiden Sie entlang der Kieferlinien und legen Sie den Kopf in eine silberbeschichtete Petrischale. Stellen Sie die Schale unter ein Stereomikroskop und verwenden Sie ein Skalpell für den sagittalen Schnitt.

Schneiden Sie den Kopf entlang der Mittellinie auf. Drehen Sie die Kopfhälfte so, dass die mediale Seite nach oben zeigt. Entfernen Sie vorsichtig das Septum, um die Endabschnitte freizulegen.

Hier zeigen wir ein vergrößertes Bild, während wir mit Pinzette Nummer drei im Skalpell das Septum entfernen. Entfernen Sie vorsichtig die mit Ihrem Fett-Epithel ausgekleideten Enden. Überführen Sie das Präparat mit ultrafeiner Pinzette Nummer 55 und dem Skalpell in eine andere silberbeschichtete Petrischale.

Trennen Sie Stücke des Riechepithels von der darunterliegenden Terminierung. Überführen Sie die Stücke des Riechepithels in ein Gefäß, das ein Milliliter ringer-Lösung ohne zweiwertige Kationen enthält. Fügen Sie dann das Papain hinzu.

Unter Verwendung von Mikroscheren bedeutet, dass das Epithel für drei Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wird, vorsichtig erneut mit Mikroscheren behandelt wird. Warten Sie weitere fünf Minuten. Mit einer flammenglasierten Pasteurpipette mit großem Durchmesser in ein Gefäß mit Stopplösung überführen, zentrifugieren für fünf Minuten und den Überstand verwerfen. Fügen Sie etwa ein Milliliter filtrierter Ringer-Lösung vorsichtig mit einer flammenglasierten Pasteurpipette mit einem Durchmesser von etwa einem Milliliter hinzu.

Stellen Sie die Lösung, die die Zellen enthält, in die Mitte von drei Glasbodenschalen. Lassen Sie die Zellen etwa eine Stunde bei vier Grad Celsius sedimentieren. Anschließend fügen Sie Ringer-Lösung hinzu.

Arbeiten Sie im abgedunkelten Licht, um die Zersetzung der Käfigverbindungen durch Umgebungslicht zu vermeiden. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das 100x-Objektiv. Stellen Sie eine Glasbodenschale, die dissoziierte orale Sinnesneuronen enthält, auf den Objekttisch des umgekehrten Mikroskops perfu.

Mit Ringer-Lösung. Schützen Sie die Spritze mit der intrazellulären Lösung, die Caged-Verbindungen enthält, mit Aluminiumfolie vor Licht und lagern Sie sie gekühlt. Suchen Sie nach einem isolierten olfaktorischen Sinnesneuron mit intakten Zilien.

Bewegen Sie den Mikroskoptisch, um die Cary-Region innerhalb des auf dem Monitor eingezeichneten Bereichs zu positionieren. Um den UV-Blitzbereich zu lokalisieren, füllen Sie eine Patch-Pipette mit intrazellulärer Lösung, die die Caging-Verbindung enthält. Führen Sie die Pipette in den Halter der Kopfstufe des Apache-Clamp-Verstärkers ein.

Unter Verwendung standardmäßiger Patch-Clamp-Techniken. Nähern Sie sich dem Soma des Neurons mit einer Patch-Pipette an und erzielen Sie eine Giga-Seal. Schalten Sie dann am Computer in den Ganzzellmodus um.

Starten Sie ein Stimulationsprotokoll und nehmen Sie die Antwort auf. Ein typisches Stimulationsprotokoll hält die Spannung auf einem konstanten Wert und löst die Freisetzung eines UV-Blitzes zur Lyse der Cage-Verbindung aus. Nun zeigen wir Ihnen einige repräsentative Aufnahmen; hier dargestellt ist die Reaktion eines isolierten sensorischen Neurons des Mausohrs auf die Lyse von Cage-Cycl-mp.

Der Pfeil oben zeigt den Zeitpunkt der Freisetzung eines UV-Blitzes an. Der von Cycl MP aktivierte Strom wurde bei minus 60 Millivolt in einer kalziumarmen Ringer-Lösung außerhalb der Zelle aufgezeichnet. Die aufsteigende Phase des Stroms war schnell und wurde durch eine einfache exponentielle Funktion angepasst.

Hier sehen wir eine Aufnahme desselben Neurons, das in einer normalen Ringer-Lösung mit einem Millimolar Calcium gehalten wurde. Die aufsteigende Phase des Stroms bei minus 60 Millivolt wurde deutlich geringer und multiphasisch. Dies ist auf die Wirkung von Calcium zurückzuführen, das in die C-recycling-P-gesteuerten Kanäle eindringt und einen sekundären Chloridstrom aktiviert.

In diesem Beispiel haben wir die Spannung bei plus 60 Millivolt fixiert. Dies ist eine weitere Möglichkeit, den Calciumeinstrom zu verringern. Die aufsteigende Phase der Antwort, die durch die Cyclon-PN-Abschirmung bei plus 60 Millivolt verursacht wurde, ließ sich gut durch eine einfache Exponentialfunktion beschreiben, was auf das Vorhandensein nur einer Stromkomponente hinweist.

Ein Beispiel für Reaktionen, die durch die lichtinduzierte Freisetzung von Calcium innerhalb der Zilien erhalten wurden, ist dargestellt; dieser Strom wird durch Chloridionen getragen. Die Spannung betrug minus 50 Millivolt. Reaktionen mit zunehmender Amplitude wurden durch die lichtinduzierte Freisetzung von „caged“ Calcium mittels UV-Blitzen zunehmender Intensität ausgelöst.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Aufnahmen von dissoziierten sensorischen Neuronen durchführt, wenn man dieses Verfahren anwendet. Es ist wichtig, daran zu denken, sehr geduldig zu sein. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg beim Experiment.