Name: Lectin-basierte Isolierung und Kultivierung von embryonalen Maus-Motoneuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung und Kultivierung embryonaler Maus-Motoneuronen mittels Lektin-basierter Aufreinigung. Diese Methode ermöglicht reine Zellkulturen für die Untersuchung motorischer Neuronenkrankheiten.

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Wir danken Sandra Bargen für einen ausgezeichneten technischen Support. Diese Arbeit wurde durch das Protein Research Department (PRD, TP A1.2 (RC und TS) und der RUB Research Fond, Rektoratsprogramme unterstützt -. Wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) Der monoklonale Antikörper 39.4D5 und F55A10 aus dem Developmental Studies Hybridoma wurden erhalten Bank (DSHB, Iowa City, IA).

Für spezielle Reagenzien: siehe Tab.. 1. Alle anderen Reagenzien aufgeführt sind in der Zellkultur-Grade-Qualität von der Firma Sigma Aldrich erhalten. 1. PORN-H/laminin Beschichtung von Geschirr / Deckgläser <ol><li> Bereiten Sie arbeiten Lösung von 0,5 mg / ml Poly-DL-Ornithin Hydrobromid (PORN-H) in 150 mM Boratpuffer pH 8,35. <ol><li> Eine Stammlösung von 50 mg PORN / 1 ml Boratpuffer kann im Voraus zubereitet werden und bei -20 ° C. </li></ol></li><li> Sterilisieren Deckgläschen durch Abflammen in 100% Ethanol und lassen Sie sie an der Luft trocknen. </li><li> Bedecken Sie die Oberfläche mit ausreichender PORN-H-Lösung über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Am nächsten Tag dreimal mit sterilem Wasser und Luft trocknen Deckgläser. </li><li> Bereiten Sie arbeiten Lösung von 2,5 g / ml Laminin in HBSS <ol><li> Aliquots bei -20 ° C gelagert werden Tauwetter bei 4 ° C unmittelbar vor dem Gebrauch. </li></ol></li><li> Bedecken Sie die Oberfläche des PORN-H-beschichtete Deckgläser mit dem Laminin-Lösung und lassen Sie sie für mindestens 2 h bei Raumtemperatur inkubieren bis zur Verwendung. </li></ol> 2. Lectin Beschichtung der Reinigung Platte <ol><li> Bereiten Sie eine Lösung aus 10 mM Tris in sterilem Wasser, pH 9,5. </li><li> Add-Lektin (lösen das Lektin (Sigma L9640)-Pulver in HBSS) auf eine Endkonzentration von 10 ug / ml. </li><li> Bestreichen Sie die Oberfläche eines 10 cm Zellkulturschale mit 8 ml der Lektin-Lösung und lassen Sie es für mindestens 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. </li><li> Waschen Sie die Platte dreimal mit HBSS und speichern in HBSS bis zur Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine 30 mm KCl, 0,8% (w / v) NaCl-Lösung Depolarisation. Sterilisieren durch Filtration und bei Raumtemperatur lagern (RT). </li></ol> 3. Motoneuron Kulturmedium <ol><li> Thaw Pferdeserum über Nacht bei 4 ° C und bei 55 ° C inaktivieren für 30 min, Aliquot in 5 ml und bei -20 ° C. Thaw Aliquot direkt vor bei RT verwenden. </li><li> Shop B27-Ergänzung in 1 ml aliqouts bei -20 ° C. Thaw B27 Ergänzung bei RT unmittelbar vor dem Gebrauch. Vermeiden Sie frieren und Auftauen. </li><li> Aliquot Glutamax in 0,5 ml Aliquots und bei -20 ° C und verwenden Sie es bei 1:100. </li><li> Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 pg / ml CNTF in sterilem Wasser mit 0,1% BSA. Lagerung bei -20 ° C. </li><li> Mix 46 ml Neurobasalmedium mit 2,5 ml Pferdeserum, 1 ml B27-Ergänzung und 0,5 ml Glutamax direkt vor dem Gebrauch. </li><li> Add CNTF zu einer Endkonzentration von 10 ng / ml Medium und pre-warmen mittel-bis 37 ° C. </li></ol> 4. Rückenmark Dissektion <ol><li> Opfere ein E12.5 schwangere Maus und entfernen Sie die Embryonen vorsichtig. Fügen Sie genug RT HBSS zur kompletten Abdeckung des Embryos. </li><li> Entfernen Sie den Kopf und Schwanz und Ort des Embryos zurück nach oben mit gespreizten Gliedmaßen. </li><li> Fix der Embryo mit einer Pinzette und entfernen Sie die äußere Haut mit den anderen Pinzette. </li><li> Entfernen des Rückenmarks durch Einstechen in die Zange unter ihm und heben Sie sie mit Säge-Bewegungen auf beiden Seiten des Rückenmarks. </li><li> Übertragen Sie die isolierten Rückenmark ein neues Gericht mit HBSS und öffnen Sie den zentralen Kanal des Rückenmarks auf der Rückenseite. </li><li> Entfernen Sie die Spinalganglien durch das Entfernen der umgebenden Hirnhäuten des Rückenmarks. </li><li> Sammeln Sie die Lendenwirbelsäule Teile des Rückenmarks von bis zu 6 Embryonen pro Lektin Platte in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß mit 1 ml HBSS und speichern auf Eis gefüllt, bis die Zubereitung erfolgt. </li></ol> 5. Anreicherung von Motoneuronen durch Lektin-basierte Reinigung Hinweis: Bevor Sie die nächsten Schritte vorbereiten spätestens hier und vorwärmen das Medium (siehe Schritt 3). <ol><li> Bereiten Sie eine Trypsin-Lösung durch das Lösen von 1 g Trypsin in 100 ml HBSS, Lagerung bei -20 ° C und Auftauen bei 4 ° C. </li><li> Mix 1g Trypsin-Inhibitor mit 98 ml HBSS und 2 ml 1 M HEPES pH 7,4, sollte 1 ml Aliquots bei 4 ° C gelagert werden </li><li> Übertragen Sie die Röhre mit dem Rückenmark zu einer Zellkultur Motorhaube und entfernen Sie vorsichtig 700 ul der HBSS. </li><li> Add 7,5 ul Trypsin-Lösung und mischen durch vorsichtiges Umdrehen des Röhrchens. </li><li> Führen Trypsinierung für 8 min bei 37 ° C. </li><li> Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 30 ul Trypsin-Inhibitor und Pipette nach oben und unten (verreiben) vorsichtig 10-15 Mal mit einem 1000 ul Pipettenspitze bis keine Zellaggregate sichtbar sind. Wiederholen Sie die Verreibung mit einem 20-200 ul Pipette und den entsprechenden Tipp. </li><li> Pipette die Zelle Lösung in die HBSS gefüllt Lektin Teller und verteilen die Zellen durch vorsichtiges Drehen der Platte. </li><li> Halten Sie das Lektin Platte für 60 min bei RT auf einem vibrationsfreien Oberfläche. Decken Sie sie, um Kontaminationen zu vermeiden. </li><li> Entfernen Sie die HBSS sehr sanft und waschen Sie die Platte vorsichtig 4 mal mit vorgewärmten HBSS um Zellfragmente und die nicht angeschlossen / ungebunden Zellen zu entfernen. </li><li> Unmittelbar nach dem letzten Waschschritt, 500 ul Depolarisation Lösung auf den Teller und lassen Sie es für 1min inkubieren. </li><li> Erleichterung der Ablösung der Lektin gebundenen Zellen durch Schütteln undAntippen der Platte. </li><li> Füllen Sie die Platte mit 2 ml vorgewärmten Kulturmedium und Transfer in ein 15 ml Falcon-Röhrchen. </li><li> Graf Zellzahl mit einer Neubauer-Zählkammer. </li><li> Platte der Zelle auf der Laminin beschichtete Deckgläser oder Platten in eine entsprechende Anzahl abhängig von der Anwendung. </li><li> Führen Sie ein Medium Austausch am Tag 1 und danach jeden zweiten Tag durch eine sorgfältige Ersatz von 50% des alten Mediums. Verwenden Sie stets vorgewärmte, frisch zubereitete neue Kulturmedium. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Embryonale Motoneurone aus Maus-Embryonen bei E12 bis E14 erhältlich. 2-3% der gesamten Zellpopulation der Lenden-Wirbelsäule besteht aus Motoneuronen und die Spinalganglien ganglionären Neuronen p75 sind NTR-positive als auch, ist es wichtig, um loszuwerden, diese Zellen vor dem Start des Lektin-basierte preplating Verfahren ( Zur Übersicht siehe Abbildung 1 und Abbildung 2). Zweitens sind die Hirnhäute stark teilenden Zellen, die ebenfalls ausgeschlossen werden sollte, da sie sich nicht richtig von der Lektin-basierte preplating Verfahren (Abbildung 2 und Abbildung 3) entfernt werden. In schlimmeren Fällen können diese Zellen überwuchern die Kultur-Platten. Die repräsentative Bilder in Abbildung 3B und 3D auch einen Eindruck über die geringere Zelldichte nach dem Waschen Verfahren durchgeführt worden sind (siehe Schritt 5.9 des Protokolls). Kulturen von embryonalen Maus-Motoneuronen sind in der Regel für bis zu fünf oder sieben Tage aufrechterhalten. Während dieser Zeit die Zellen zu etablieren ihre Neuriten bis zu einer maximalen Länge (Abbildung 4). Neuritenlängen stark abhängig von dem Substrat, auf die Platten 8. Das typische Substrat Laminin, die auf PORN-H abgedeckt Kulturschalen beschichtet ist. Motoneuronen können auch wachsen auf anderen oder weniger definierten Substraten, wie extrazelluläre Matrix durch Wasser Lyse 8 erzeugt. In Fällen von suboptimal Beschichtung, Neuritenlänge und Wachstum Membranfläche verringert und Zelltod in der Regel erhöht. Trophische Unterstützung spielt eine entscheidende Rolle für das Überleben von embryonalen Maus-Motoneurone in Kultur. Survival of zunächst vernickelt Zellen am siebten Tag fallen auf 10% bis 20% ohne trophische Träger 6. Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktor (BDNF) und Ciliary neurotrophen Faktors (CNTF) sind die am häufigsten verwendeten Faktoren, aber andere können das Überleben als auch [Leukämie inhibierenden Faktor (LIF), Cardiotrophin-1 (CT-1), basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF fördern ), Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) 9]. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Fließschema für die Herstellung von embryonalen Maus-Motoneuronen. Die schematische Zeichnung zeigt die verschiedenen Schritte zur Isolierung und Kultivierung von embryonalen Maus-Motoneuronen. Abkürzungen: SC: Rückenmark; HBSS: Hanks balanced salt solution, MN: Motoneuron. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2: Isolierung der Lendenwirbelsäule Teil des Rückenmarks von E12.5 Maus A:.. E12.5 Maus-Embryo. Für den nächsten Schritt werden die Kopf und Schwanz entfernt und der Körper wird in eine dorsale-up-Position B gestellt: Embryo in eine dorsale-up-Position. Zange an der linken und rechten Seite des Rückenmarks sind Festsetzung des Embryos Körper in seiner Position. Einer der Pinzette wird anschließend verwendet, um die Haut zu schneiden und unter dem Rückenmark der anderen verwendet werden, um den Embryo in seiner Position zu fixieren geschnitten wird C:. Isolated Rückenmark von E12.5 Maus-Embryo. Die Teile des Rückenmarks (Hals-, Brust-, Lenden-) angegeben. Das Rückenmark wird durch den Hirnhäuten umgeben und ein Teil der Spinalganglien noch mit ihnen verbundenen D:. Das Rückenmark ist in Längsrichtung auf der Rückenseite geschnitten, um es in Richtung des zentralen Kanals geöffnet E:. Die Meningen an der Bauchseite sind jetzt aus dem abgeflachten Rückenmark entnommen. Hinweis: Während abgenommen, die Lendenwirbelsäule wird durch einen kleinen Schnitt markiert F:. Nur der Lendenwirbelsäule Teil des Rückenmarks wird dann für das weitere Vorgehen getroffen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3: Bestimmung und Isolierung von Islet-positive Zellen aus der Lenden-Wirbelsäule von E12.5 Mausembryonen A:.. Die Islet-2.1-Antikörper Etiketten Motoneuron Spalten innerhalb der embryonalen Lumbalmark (rot, Pfeil) und Hoechst Etiketten alle Kerne innerhalb der Sektion. Querschnitt eines E12.5 Lumar Rückenmark. E12.5 Maus Embryonen wurden in 4% Paraformaldehyd für 6 h Immersion-fixiert, gewaschen 3-mal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung und mit Saccharose nach Standardverfahren. Kryoschnitte von 20 &amp;mgr; m wurden mit einem Kryostaten genommen und die Schnitte wurden immunhistochemische Färbung nach Standardverfahren 11 behandelt. Die Abschnitte ware anschließend mit Hoechst zur Lokalisation der Zellkerne gekennzeichnet. Beachten Sie, dassder Spinalganglien ganglionären Neuronen Islet-1/2-positive so gut und dass die Vorbereitung Verfahren schließt diese Gewebeteile aus der Isolation Verfahren B:. Islet-2.1 gekennzeichnet (rot, Pfeil) dissoziiert Lumbalmark Zellen von E12. 5 Embryonen, links - vor und rechts - nach Lektin-basierte preplating. Die Zellen wurden mit Hoechst gegengefärbt, um alle Zellkerne sichtbar zu C:. Quantifizierung der Islet-1/2-positive Zellen vor und nach Lektin-basierte preplating D:. Nkx6.1 gekennzeichnet Motoneuronen von E12.5 Embryonen nach einem Tag in Kultur. Die Zellen wurden mit Hoechst gegengefärbt, um alle Kerne cisualieze. Beachten Sie, dass 90% aller Zellen Nkx6.1 positiv sind. Abkürzungen: SC: Rückenmark, MN: Motoneuron; DRG: Spinalganglien. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4 Charakterisierung von E12.5 Maus Motoneuronen A und B:.. Angereichert isoliert E12.5 Maus Lendenwirbelsäule Motoneuronen ausdrückliche p75 NTR auf 0 Tage in vitro (0div) und am Tag 2 in vitro (2div). Die Zellen wurden mit 4% Paraformaldehyd fixiert und anschließend für p75 NTR nach üblichen Verfahren gefärbt. Die Zellen wurden gegengefärbt mit Hoechst zu allen Kernen visualisieren C:. Enriched Motoneuronen nach 5 Tagen in vitro (5cm) auf PORN-H und Laminin als Kultur Substraten und in Gegenwart von CNTF gefärbt β-III-Tubulin. Beachten Sie, dass die Zellen haben lange Neuriten gewachsen und zeigt die typische Morphologie Motoneuron mit einer längeren (verzweigte)-Prozess und einem oder mehreren kürzeren Prozessen (Axone und Dendriten). Abkürzungen: MN: Motoneuron; div: Tage in vitro. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="3"> Nach Dissoziation ohne Lektin-basierte preplating </td></tr><tr><td> Anzahl der Zellen / SC </td><td> Trypanblau-positiven Zellen [%] </td><td> Islet-1/2- positiven Zellen [%] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 995,0 </td><td> 13,1 </td><td> 9,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 889,4 </td><td> 8,0 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 1.180.0 </td><td> 11,0 </td><td> 10,8 </td></tr><tr><td> Mittelwert ± SD </td><td> 1.021.0 ± 147,1 </td><td> 10,7 ± 2,6 </td><td> 10,1 ± 0,7 </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td> Mit Lektin-basierte preplating </td></tr><tr><td> Anzahl der Zellen nach preplating / SC </td><td> Trypanblau-positiven Zellen [%] </td><td> Islet-1/2- positiven Zellen [%] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 189,6 </td><td> 9,9 </td><td> 70,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 168,8 </td><td> 3,7 </td><td> 76,1 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 125,0 </td><td> 0,0 </td><td> 72,5 </td></tr><tr><td> Mittelwert ± SD </td><td> 161,1 ± 33,0 </td><td> 4,5 ± 5,0 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Zusammenfassung von repräsentativen Verfahren zur Isolierung von Maus embryonalen Motoneuronen von Stufe E12.5. Die Ergebnisse aus 3 verschiedenen Verfahren zur Isolierung von speziell für diesen Zweck als Gesamtzahl oder Prozentzahlen ± SD angegeben. Abkürzung: SC: Rückenmark, SD: Standardabweichung. <table border="1"><tbody><tr><td> Islet-2.1-positiven Zellen mit p75 Panning [%] </td><td> Islet-2.1-positiven Zellen mit Lectin-based Panning [%] </td></tr><tr><td> 92,0 ± 3,5 1 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Vergleich von Lektin-basierte und p75-basierte 1 Panning Motoneuron Zellzahlen. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz Zahlen ± SD angegeben.

<ol><li>Vallstedt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+levels+of+repressor+activity+assign+redundant+and+specific+roles+to+Nkx6+genes+in+motor+neuron+and+interneuron+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification.</a> Neuron. 31, 743-755 (2001).</li>
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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Der Vorteil dieses Lektin-basierte preplating Technik ist, dass es weniger teuer als die p75 NTR-based Panning Prozedur ist, und das Lektin ist stabiler als Antikörper. Die Anreicherung in Abb. aufgeführt. 2 und Tab. 1 zeigt, dass das Verfahren erlaubt es, die Reinigung von ähnlichen Zahlen aus Zellen und dass ein Großteil dieser Zellen exprimieren das Motoneuron Marker Islet-02.01. Der wichtigste Schritt ist die Isolierung Verfahren für die Lenden-Wirbelsäule. Das Entfernen der Hirnhäute und der DRGs (Abb. 2) wird für die folgenden Reinigungsverfahren von Lektin-basierte preplating unerlässlich. Wenn dies richtig verwaltet worden, Express nahezu allen Zellen des p75 NTR (für repräsentatives Bild siehe Abb.. 3a). Der Grund für den Unterschied zwischen Ausdruck Islet-2.1-und p75 NTR ist wahrscheinlich, weil lumbalen Motoneuronen differentiell höheren und niedrigeren Ebenen des Islet-1 / 2 10 zum Ausdruck bringen. Im Falle einer niedrigen Islet-2.1 Expression könnte dies unsere Aufmerksamkeit in der immuncytochemical Färbung und anschließende Zählung entgangen sein, wie wir strengen Bezug auf positive gegen negative Zellen (Tab. 1) waren. Zusätzlich Tabelle 1 zeigt deutlich, dass die isolierten Zellen die Prozedur überleben in einem gesunden Zustand, denn es gibt nur wenige Trypan-Blau-positive Zellen, dass die Zellen irreversibel geschädigt anzuzeigen. Diese alternativen Verfahren ermöglicht auch Isolierung von Motoneuronen aus einzelnen Embryonen und daher mit gemischten Genotyp Würfe aus embryonalen Mäuse. Im Ergebnis hat diese Alternative zu den Panning Prozedur mit dem p75 NTR Antikörper 6 ähnliche, wenn nicht identisch Kapazitäten im Hinblick auf mögliche Anwendungsbereiche und bietet eine preiswerte und effiziente Alternative Reinigungsverfahren für embryonalen Motoneuronen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Poly-DL-Ornithin Hydrobromid </td><td> Sigma </td><td> P8638 </td><td></td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> Thermo </td><td></td><td> Ø 10 oder 14mm </td></tr><tr><td> Lectin </td><td> Sigma </td><td> L5142 </td><td></td></tr><tr><td> Zellkulturschale </td><td> Nunc </td><td> 150350 </td><td> Nunclon delta Oberfläche </td></tr><tr><td> Pferdeserum </td><td> Linaris </td><td> SHD3250ZK </td><td> Jede Charge hat für MN Kultur getestet werden </td></tr><tr><td> B27 Supplement </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Gibco </td><td> 35050-038 </td><td></td></tr><tr><td> CNTF </td><td> Sigma </td><td> N0513 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Applichem </td><td> A1391 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-041 </td><td></td></tr><tr><td> Zange </td><td></td><td></td><td> Edelstahl, Größe 4 oder 5 </td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Worthington </td><td> LS003707 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin-Inhibitor </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Islet-1 </td><td> DSHB </td><td> 39.4D5 </td><td> Zellkulturüberstand </td></tr><tr><td> Anti-Nkx6.1 </td><td> DSHB </td><td> F55A10 </td><td> Zellkulturüberstand </td></tr><tr><td> Anti-p75 NTR </td><td> Abcam </td><td> Ab8874 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Table of spezifischen Reagenzien und Geräte.

lectin-basierte isolierung und kultivierung von embryonalen maus-motoneuronen

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal Motoneuronen zu entwickeln in Richtung postmitotischen Etappen durch die frühe embryonale Entwicklung des Nervensystems und in der Folge wachsen Dendriten und Axone. Neuroepithelzellen des Neuralrohrs, dass ausdrückliche Nkx6.1 die einzigartige Vorläuferzellen für spinale Motoneurone 1 sind. Obwohl postmitotischen Motoneuronen auf ihre endgültige Position bewegen und organisieren sich in Spalten entlang der tractus 2,3. Mehr als 90% aller dieser differenzierten und positioniert Motoneuronen drücken die Transkriptionsfaktoren Islet 1 / 2. Sie innervieren die Muskeln der Extremitäten sowie die des Körpers und die inneren Organe. Unter anderem Motoneuronen in der Regel drücken die Rezeptoren mit hoher Affinität für Gehirn neurotrophen Faktor (BDNF) und Neurotrophin-3 (NT-3), der Tropomyosin-verwandte Kinase B und C (TrkB, TrkC). Sie drücken nicht die Tropomyosin-verwandte Kinase A (TrkA) 4. Neben den beiden Rezeptoren mit hoher Affinität, tun Motoneuronen Ausdruck der geringen Affinität Neurotrophin-Rezeptor p75 NTR. Die p75 NTR können alle Neurotrophine mit ähnlichen, aber niedriger Affinität binden alle Neurotrophine als die Rezeptoren mit hoher Affinität würde die reifen Neurotrophine binden. Innerhalb der embryonalen Rückenmark, ist die p75 NTR ausschließlich durch die spinale Motoneuronen 5 ausgedrückt. Dies wurde genutzt, um Motoneuron Isolierung Techniken zu entwickeln, um die Zellen von der überwiegenden Mehrheit der umliegenden Zellen 6 zu reinigen. Isolating Motoneuronen mit Hilfe von spezifischen Antikörpern (Panning) gegen die extrazellulären Domänen von p75 NTR hat sich ein teures Verfahren, wie die Menge des Antikörpers für ein einzelnes Experiment verwendeten hoch ist aufgrund der Größe der Platte für das Panning verwendet werden eingeschaltet. Eine viel günstigere Alternative ist die Verwendung von Lektin. Lectin hat sich gezeigt, dass sie spezifisch an p75 NTR sowie 7 zu binden. Die folgende Methode beschreibt eine alternative Technik mit Weizenkeimagglutinin für eine preplating Verfahren anstelle der p75 NTR-Antikörper. Das Lektin ist eine äußerst kostengünstige Alternative zu den p75 NTR-Antikörper und die Reinigung Sorten mit Lektin sind vergleichbar mit der des p75 NTR-Antikörper. Motoneurone aus dem embryonalen Rückenmark mit dieser Methode isoliert werden können, zu überleben und wachsen aus Neuriten.

Ein alternativer Weg zur Isolierung von embryonalen Maus-Motoneurone aus dem Rückenmark beschrieben. Die Methode berücksichtigt die Tatsache, dass Lektin kann die geringe Affinität nerve growth factor receptor p75NTR binden. Das Lektin-basierte preplating ermöglicht eine Reinigung ähnlich wie mit einem spezifischen Antikörper gegen das p75NTR.

Lectin-basierte Isolierung und Kultivierung von embryonalen Maus-Motoneuronen

Spinale Motoneurone entwickeln sich im Zuge der frühen embryonalen Entwicklung des Nervensystems hin zu postmitotischen Stadien und lassen anschließend Dendriten und Axone auswachsen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine angereicherte Kultur embryonaler motorischer Neurone der Maus zu erhalten. Das Verfahren beginnt damit, eine trächtige Maus zu töten, die Embryonen zu entnehmen und das lumbale Rückenmark zu präparieren. Im nächsten Schritt wird das Rückenmark durch enzymatische Behandlung und Dauer in eine Einzelzell-Suspension dissoziiert. Danach erfolgt die Lektin-basierte Reinigung zur Trennung der Motoneurone von den übrigen Zellen. Anschließend werden die Zellen nach Schätzung der Gesamtzellzahl auf vorcodierten Schalen oder Deckgläsern ausplattiert. Der letzte Schritt besteht darin, die Dichte der Kultur je nach experimentellem Verfahren anzupassen.Schließlich, wenn sich die kultivierten Zellen vermehren, kann die typische Morphologie von Motoneuronen beobachtet werden. Für den Erfolg ist es bei der Kultivierung von Mäusezellen und Motoneuronen unerlässlich, verschiedene Materialien, Substanzen und Lösungen zu testen. Da die Zellen empfindlich auf Veränderungen bei diesen Komponenten reagieren können, lassen sich die Motoneuronen in hoher Dichte kultivieren, um RNA oder Proteine zu isolieren.Jedoch besteht die Möglichkeit, dass die Zellen aktive neuronale Netze aufbauen, die unabhängig von der Verkehrsförderung überleben. Daher kann es in einigen Fällen besser sein, die Zellen bei geringer Dichte für die RNA- oder Proteinanalyse zu kultivieren. Dieses Verfahren werden Rebecca Conrad und Terza Japan demonstrieren. Beide sind Doktorandinnen in unserem Labor.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Arbeitslösung mit 0,5 Milligramm pro Milliliter Poly-DL-Ornithin-Hydrobromid in 150 Millimolar Bide-Puffer mit pH 8,35 vorbereiten und die Lösung durch Filtration sterilisieren. Anschließend sterilisieren Sie die Glasdeckgläser, indem Sie sie in 100 % Ethanol verglühen. Lassen Sie sie dann lufttrocknen und bedecken am nächsten Tag über Nacht die Oberfläche der Deckgläser bei vier Grad Celsius mit ausreichend Porn-H-Lösung.Spülen Sie sie dreimal mit sterilisiertem Wasser. Danach lassen Sie sie an der Luft trocknen. Bereiten Sie die Arbeitslösung mit 2,5 Mikrogramm pro Milliliter vor.Laminin in HBSS bedeckt die Oberfläche der porn H-beschichteten Deckgläser mit der Laminin-Lösung. Anschließend inkubieren Sie diese mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur bis zur Verwendung. Der nächste Schritt besteht darin, eine Lösung von 10 Millimolar Triss in sterilisiertem Wasser mit einem pH-Wert von 9,5 herzustellen.Nach der Filtration der Lösung wird Lectin in einer Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter zur Mischung gegeben. Anschließend wird die Oberfläche einer 10 cm großen Zellkulturschale mit acht Millilitern der Lectin-Lösung beschichtet und mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird die Schale dreimal mit HBS S gewaschen und bis zur Verwendung in HBSS aufbewahrt.Danach die Depolarisationslösung mit 30 Millimolar Kaliumchlorid und 0,8 % Natriumchlorid herstellen. Anschließend die Mischung durch Filtration sterilisieren und bei Raumtemperatur lagern. Um dieses Verfahren zu beginnen, das Pferdeserum über Nacht bei vier Grad Celsius auftauen.Anschließend bei 55 Grad Celsius für 30 Minuten inaktivieren, in Portionen zu je fünf Milliliter aliquotieren und die Aliquote bei minus 20 Grad Celsius lagern. Vor der Verwendung ein Aliquot direkt bei Raumtemperatur auftauen. Danach B-27 Supplement in Aliquoten zu je einem Milliliter bei minus 20 Grad Celsius lagern.Unmittelbar vor der Verwendung bei Raumtemperatur auftauen. Vermeiden Sie Einfrier- und Auftauzyklen; portionieren Sie Glutamat in Aliquots zu 0,5 Milliliter und lagern Sie diese bei minus 20 Grad Celsius. Bereiten Sie dann eine Stammösung von 10 Mikrogramm pro Milliliter CNTF in sterilisiertem Wasser mit 0,1 % BSA vor und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius.Mischen Sie abschließend 46 Milliliter Neurobasal-Medium mit 2,5 Milliliter Pferdeserum, 1 Milliliter B27-Zusatz und 0,5 Milliliter Glutamat. Fügen Sie CNTF so hinzu, dass eine Endkonzentration im Medium von 10 Nanogramm pro Milliliter erreicht wird. Prewarmen Sie es auf 37 Grad Celsius.Zu diesem Zeitpunkt ein schwangeres 12,5 Tage altes Embryonalmaus opfern und die Embryonen vorsichtig entfernen. Raumtemperatur-S HBSS hinzufügen, um die Embryonen vollständig zu bedecken, und einen Embryo unter ein Mikroskop bringen. Anschließend den Kopf und Schwanz entfernen und den Embryo mit gespreizten Gliedmaßen rücklings platzieren.Befestigen Sie danach das Embryo mit einem Paar Pinzetten und entfernen Sie die äußere Haut mit dem anderen Paar Pinzetten. Entfernen Sie anschließend das Rückenmark, indem Sie die Pinzette darunter durchstechen, und heben Sie es durch sägeartige Bewegungen auf beiden Seiten des Rückenmarks an. Überführen Sie das isolierte Rückenmark in eine neue Schale mit HBSS.Öffnen Sie den zentralen Kanal des Rückenmarks an der dorsalen Seite. Entfernen Sie anschließend die dorsalen Wurzelganglien, indem Sie die eingeschlossenen Meningen des Rückenmarks entfernen. Überführen Sie dann die Rückenmarksstränge in ein EOR-Reaktionsröhrchen, das mit einem Milliliter HBSS gefüllt ist.Halten Sie sie bis zur Vorbereitung der Rückenmarkverdauung auf Eis. Überführen Sie das Röhrchen mit den Rückenmarken in eine Zellkulturhaube. Entfernen Sie vorsichtig 700 µL des HBSS und geben Sie anschließend 7,5 µL der zuvor wie im begleitenden Manuskript beschrieben hergestellten 1 %igen Trypsin-Lösung hinzu.Und mischen Sie durch vorsichtiges Invertieren des Gefäßes. Führen Sie die Trypsinisierung acht Minuten lang bei 37 Grad Celsius durch. Stoppen Sie dann die Reaktion durch Zugabe von 30 Mikroliter Trypsininhibitor und pipettieren Sie vorsichtig 10 bis 15 Mal mit einer 1000-Mikroliter-Pipettenspitze auf und ab, bis keine Zellaggregate mehr sichtbar sind.Anschließend die Vorgänge mit einer 20 bis 200 µL-Pipette wiederholen. Die Zelllösung in die mit HBSS gefüllte Lektinplatte pipettieren und die Zellen durch vorsichtiges Schwenken der Platte verteilen. Die Lektinplatte abdecken, um Kontaminationen zu vermeiden, und 60 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einer vibrationsfreien Oberfläche stehen lassen.Entfernen Sie das HBSS sehr vorsichtig und waschen Sie die Platte viermal sorgfältig mit vorgewärmtem HBSS, um Zellfragmente und nicht angeheftete Zellen zu entfernen. Fügen Sie unmittelbar nach dem letzten Waschschritt 500 Mikroliter der Depolarisationslösung mit 30 Millimolar Kaliumchlorid und 0,8 % Natriumchlorid zur Platte hinzu und inkubieren Sie sie eine Minute lang. Schütteln und klopfen Sie leicht auf die Platte, um die Ablösung der lectinbindenden Zellen zu erleichtern. Füllen Sie die Platte mit zwei Milliliter vorgewärmtem Kulturmedium auf und überführen Sie sie anschließend in ein 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen.Zählen Sie die Zellanzahl mit einer Neubauer-Zählkammer. Anschließend säen Sie die Zellen auf lamininbeschichteten Deckgläsern oder Platten aus. Wechseln Sie das Medium am ersten Tag und danach alle zwei Tage, indem Sie vorsichtig 50 % des alten Mediums durch frisch zubereitetes, vorgewärmtes Kulturmedium ersetzen.Das hier gezeigte Medium zeigt einen Querschnitt des embryonalen lumbalen Rückenmarks von 12,5 Tagen mit Färbung für herst zur Lokalisierung der Zellkerne. Der Pfeil zeigt die Motoneuronensäulen im embryonalen lumbalen Rückenmark an, die mit dem Eyelet-eins-zwei-Antikörper markiert sind. Ein Beispiel für eyelet-eins-zwei-markierte dissoziierte Zellen.Lumberspinale Zellen aus embryonalen 12,5-Embryonen vor und nach der auf Lektinen basierenden Präplattierung sind im linken bzw. rechten Panel dargestellt. Die quantitativen Ergebnisse der eyelet one two-positiven Zellen vor und nach der auf Lektinen basierenden Präplattierung werden hier gezeigt. Hier ist ein Beispiel, das die angereicherten Motoneurone am Tag null und Tag zwei veranschaulicht; die Zellen wurden mit 4 % Paraldehyd fixiert und anschließend für P 75 NTR gefärbt.Nach Standardverfahren wurden sie anschließend mit Haken gefärbt, um nach fünf Tagen in vitro alle Kerne sichtbar zu machen, wobei Porn H und Laminat als Kultursubstrate sowie CNTF für die Beta-drei-Tubulin-Färbung verwendet wurden. Die Zellen hatten lange Neuriten ausgebildet und zeigten die typische Motoneuron-Morphologie mit einem längeren und einem oder mehreren kürzeren Fortsätzen. Motoneurone spielen im Körper aller Wirbeltiere und Wirbellosen eine zentrale Rolle.Diese Isolierung ist äußerst nützlich für die Analyse der Überlebensmechanismen von Motoneuronen. Mit den isolierten Zellen können Sie gezielt die Aktivitäten anderer wechselwirkender Zellen, Proteine, Kohlenhydrate analysieren und pharmakologische Substanzen auf das Überleben und das neurologische Wachstum dieser Zellen anwenden.

lectin-based-isolation-and-culture-of-mouse-embryonic-motoneurons

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir entwickelten ein neues Protokoll, um die Effizienz der in vitro Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen zu verbessern. Die differenzierten ES-Zellen erworbenen motorischen Neuronen verfügt wie durch die Expression von neuronalen und motorischen Neurons Marker mit Hilfe von immunhistochemischen Techniken nachgewiesen.

Effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen

Wir beschreiben eine schnelle Methode zur Isolierung und Kultur hippokampalen und kortikalen Neuronen aus Nagetier Embryonen. Dieses Protokoll erlaubt es uns, Experimente, in denen nahezu reinen neuronalen Kulturen sind erforderlich, durchzuführen.

Isolierung und Kultivierung von embryonalen Ratten-Nervenzellen: ein Quick-Protokoll

Isolierung von embryonalen Neuralleiste vom Neuralrohr erleichtert die Verwendung...

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

Das Video zeigt die Isolierung von okulomotorischen, trochleären und spinalen Motoneuronen aus einem transgenen Mausembryo. Der Embryo exprimiert Motoneuronen, die zur einfachen Visualisierung und Identifizierung mit einem grün fluoreszierenden Protein (GFP) markiert sind. Die Motoneuronen werden chirurgisch unter einem Fluoreszenzmikroskop isoliert und in einem Kulturmedium aufbewahrt.

Isolierung und Kultur von okulomotorischen, trochleären und spinalen Motoneuronen aus einem Mausembryo

Dieses Video zeigt ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von primären Großhirnrindenzellen aus dem dorsolateralen Telencephalon von Mausembryonen.

Isolierung und Kultivierung von Zellen aus dorsolateralen Telencephalonen von Mausembryonen

Das Video zeigt den Prozess der Isolierung und Kultivierung von Dopamin-Neuronen aus dem Mittelhirn von Mausembryonen. Die isolierten ventralen Mittelhirnböden werden mit Hilfe von Enzymen dissoziiert. Die resultierenden Dopamin-Neuronen werden geerntet und in Mikroinseln in Multi-Well-Platten übertragen. Die Zellen werden mit einem Dopamin-Neuronenmedium inkubiert, um die Zellen in den Mikroinseln auf einer hohen Dichte zu halten.

Isolierung und Kultivierung von primären embryonalen Dopamin-Neuronen aus dem Mittelhirn der Maus

Wir demonstrieren ein Zellkulturprotokoll für die direkte Untersuchung von neuronalen und glialen Komponenten des enterischen Nervensystems. Eine Neuron/Glia-Mischkultur auf Deckgläsern wird aus dem myenterischen Plexus einer adulten Maus hergestellt und bietet die Möglichkeit, die Funktion einzelner Neuronen und Gliazellen elektrophysiologisch, immunhistochemisch usw. zu untersuchen.

Ein<em&gt; In-vitro</em&gt; Vorbereitung von isolierten Neuronen und Glia Enteric vom Plexus myentericus der erwachsenen Maus

Diese Studie stellt eine Technik für die Isolierung von Neuronen aus WT neonatalen Mäusen vor. Es erfordert die sorgfältige Sezierung des Rückenmarks aus der neonatalen Maus, gefolgt von der Trennung von Neuronen aus dem Rückenmarksgewebe durch mechanische und enzymatische Spaltung.

Wirbelsäule Neuronen Isolierung und Kultur aus neonatalen Mäusen

Das Ziel dieser Technik ist eine hoch angereicherte Kultur der primären Motoneurone (MNs) aus murinen Rückenmark vorzubereiten. Um die Folgen von Mutationen MN Krankheiten verursachen zu bewerten, beschreiben wir hier die Isolation dieser isolierten MNs und ihre Transfektion von Magnetofection.

Charcot-Marie-Zahn Krankheit In Vitro Modellierung durch Transfecting Maus primären Motoneurone

Hier stellen wir eine neuartige mikrochirurgische Technik für die Isolierung von neuralen Stammzellen aus E13 Maus Embryo ganglionic Eminenz.

Isolation und Kultur der embryonalen Maus neurale Stammzellen

Diese Arbeit stellt ein Protokoll vor, um homogene Zellkulturen von primären okulomotorischen, Trochlea- und Spinalmotorneuronen zu ergeben. Diese Kulturen können für vergleichende Analysen der morphologischen, zellulären, molekularen und elektrophysiologischen Eigenschaften von augen- und spinalmotorischen Neuronen verwendet werden.

Isolation und Kultur von Okulomotor, Trochlea, und Spinal Motor Neuronen von pränatalen Islmn:GFP Transgene Mäuse

Erfahren Sie die Isolierung und Kultivierung embryonaler Maus-Motoneuronen mittels Lektin-basierter Aufreinigung. Diese Methode ermöglicht reine Zellkulturen für die Untersuchung motorischer Neuronenkrankheiten.

Lectin-basierte Isolierung und Kultivierung von embryonalen Maus-Motoneuronen

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