Experimentelle Erzeugung von Karzinom-assoziierte Fibroblasten (CAF) von menschlichen Brustkrebszellen Fibroblasten

Dieses Video beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung karzinomassoziiierter Fibroblasten oder Calfs aus primär kultivierten menschlichen Zellen. Karzinom-Fibroblasten sind komplexe Gewebe, die aus neoplastischen Zellen und einem nicht-krebsösen Kompartiment, dem sogenannten Stroma, bestehen. Das tumormarkierte Stroma besteht aus extrazellulärer Matrix und einer Vielzahl von Stromazellen, einschließlich Fibroblasten, Myofibroblasten, endothelialen Zellen, Parasiten und Leukozyten. Karzinomassoziierte Fibroblasten sind reich an Myofibroblasten, einem Kennzeichen aktivierter Fibroblasten, die im Tumor vorkommen.

Stromazellen spielen eine wichtige Rolle bei der Tumorentwicklung. Diese können in vitro erzeugt werden, indem primäre humane Brustfibroblasten aus gesundem Brustgewebe, das durch eine Reduktionsmammoplastie gewonnen wurde, isoliert werden. Das gewonnene Gewebe wird in eine Einzelzell-Suspension dissoziiert, anschließend immortalisiert durch virale Transduktion und so modifiziert, dass es GFP und ein Puromycin-Resistenzgen exprimiert.

Anschließend werden die Zellen gemeinsam mit humanen Brustkarzinom-MCF-7-Zellen subkutan in eine immundefiziente Maus injiziert. Die injizierten humanen memory-Fibroblasten entwickeln sich zu tumorfördernden kalförmigen Myofibroblasten.

Dann werden die parental humor mammary Fibroblasten aus Tumor-Xenografts gewonnen und in Gegenwart von Purmycin kultiviert. Die resultierenden, Purmycin-resistenten Zellen, die als experimentell generierte Calfs oder exp Calfs bezeichnet werden, zeigen in immunhistochemischen Analysen, dass ursprünglich vorhandene, normale humane Memory-Fibroblasten innerhalb des Tumor-Xenografts zu Calf-Myofibroblasten differenzieren, die die Fähigkeit erworben haben, die Tumorgenese zu fördern. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Gewinnung primärer Cals aus Brustkrebspatienten, besteht darin, dass wir in der Lage sind, Calfs experimentell aus humanen Brust-Fibroblasten mittels Co-Implantationstumor zu generieren.

Als allgemeines Modell, das das Verfahren demonstriert, werden Kar, ein Postdoktorand in meinem Labor, und Ahmed Kar, ein Doktorand im Labor, dienen. Beginnen Sie mit einem Gramm gesundem menschlichem Brustgewebe, das aus einer Reduktionsmammoplastie isoliert wurde. Spülen Sie das Gewebe mehrmals in PBS aus, geben Sie es dann in eine 15 cm große Petrischale und zerkleinern Sie es mit einer sterilen Rasierklinge in kleine Fragmente mit einer Größe von weniger als 1,5 mm³.

Als Nächstes überführen Sie die Gewebefragmente mit dem Rasiermesser in ein 15-Milliliter-Konischgefäß, das pro halbem Gramm Gewebe 10 Milliliter Zell-Dissociationspuffer enthält. Anschließend vortexen Sie eine Minute lang bei maximaler Geschwindigkeit. Stellen Sie das Gefäß auf einen Schüttler in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator und lassen Sie die Gewebefragmente 12 bis 18 Stunden lang verdauen.

Am nächsten Tag befinden sich im Vortex des Reaktionsgefäßes noch immer zahlreiche unverdaute Gewebefragmente. Zunächst das Gefäß für fünf Minuten bei Raumtemperatur ohne Agitation auf die Laborfläche stellen, nachdem es zuvor maximal zentrifugiert wurde. Anschließend den resultierenden stromalen Zellen angereicherten Überstand mithilfe einer fünf Milliliter-Physiologiepipette in ein neues kegelförmiges Reaktionsgefäß überführen.

Anschließend die stromale Fraktion fünf Minuten bei 250 × g zentrifugieren. Nach dem Zentrifugieren das Zellpellet in PBS resuspendieren und dann den Gewinn erneut fünf Minuten bei 250 × g zentrifugieren. Danach das Pellet in DMEM resuspendieren, das mit 10 % FCS ergänzt wurde, und in eine 15 cm große Petrischale überführen.

Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach acht bis zehn Tagen sollten die Zellen konfluent sein. Zu diesem Zeitpunkt werden die Zellen geerntet und können für die Langzeitlagerung eingefroren werden.

Um die isolierten primären humanen normalen Gedächtnis-Fibroblasten zu immortalisieren, führen Sie einen retroviralen PMIG-Vektor ein, der sowohl H turt als auch GFP exprimiert, kultivieren Sie die Zellen für vier bis fünf Tage und sortieren Sie anschließend die GFP-positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie. Führen Sie einen retroviralen P babepuro-Konstrukt, der ein Puromycin-Resistenzgen kodiert, in die mit GFP markierten immortalisierten Fibroblasten ein. Kultivieren Sie die Zellen für fünf bis sieben Tage in Gegenwart von Puromycin in einer Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter.

Um die GFP-markierten, Puromycin-resistenten, immortalen menschlichen Gedächtnis-Fibroblasten zu isolieren. Danach prüfen, ob die Fibroblasten aktive Viren produzieren, die zur horizontalen Genübertragung der Gene für GFP und Puromycin-Resistenz führen können. Kultivieren Sie 2,5 × 10⁵ Puromycin-resistente, immortale menschliche Gedächtnis-Fibroblasten zwei Tage lang in einer 6 cm Petrischale.

Sammeln und filtrieren Sie das konditionierte Medium der Fibroblasten mit einem Spritzfilter der Porengröße 0,45 Mikrometer. Geben Sie anschließend 10 T und eine halbe Maus-Fibroblastenzelle hinzu und kultivieren Sie für 12 Stunden in Gegenwart von fünf Mikrogramm pro Milliliter Protein Sulfat, wodurch die Effizienz der Virusinfektion nach Ablauf von 12 Stunden erhöht wird. Wechseln Sie das Medium zu DMEM, ergänzt mit 10 % FCS, und kultivieren Sie weitere zwei Tage.

Untersuchen Sie die Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie. 10 T und eine halbe Zelle, die mit GFP-Virus infiziert sind, zeigen GFP-Positivität. Ersetzen Sie nun das Medium, um die Zellen mit einem Mikrogramm pro Milliliter zu behandeln.

Pur­my­cin für fünf bis sieben Tage. Überprüfen Sie die Zellen erneut mittels Fluoreszenzmikroskopie, um festzustellen, ob sich Kolonien aus Pur­my­cin-resistenten tent und a half-Zellen gebildet haben. Beachten Sie, dass der horizontale Gentransfer durch aktive Viren, die von den elterlichen Pur­my­cin-resistenten, mit GFP markierten humanen Brustfibroblasten produziert werden, die umgebenden Pur­my­cin-empfindlichen murinen Zellen und Karzinomzellen beeinflussen könnte.

Pur-Mycin-resistente und GFP-positive Zellen im Tumor-Xenograft. Dies könnte den Prozess der Isolierung der injizierten, mit GFP markierten, Pur-Mycin-resistenten humanen Brustfibroblasten aus dem Tumor-Xenograft behindern, um experimentell karzinomassoziierte Fibroblasten für die Injektion in eine immundefiziente Maus zu gewinnen. Beginnen Sie damit, die gerade vorbereitete humane Brustzelllinie zusammen mit der humanen Brustkarzinom-Zelllinie MCF seven RAs in neuen Mikroabfallröhrchen mit Trypsin zu behandeln und die Zellen zu zählen.

Suspendieren Sie eine mal zehn hoch sechs mc770RAs humane Brustkarzinomzellen und dreimal zehn hoch sechs GFP-markierte, Puromycin-resistente, immortalisierte humane Brustfibroblasten in 400 Mikroliter Kulturmedium mit 50 % Matrigel pro Injektion. Stellen Sie die Röhrchen als Kontrolle auf Eis.

Bereiten Sie außerdem dieselben humanen Brustfibroblasten ohne die MCF-seven-RAs-Zellen vor. Injizieren Sie anschließend mit einer 27-Gauge-Nadel das Zellgemisch an eine subkutane Stelle einer immundefizienten Nude-Maus, um die intratumorale Variation der Kälber-Phänotypen zu untersuchen. Isolieren Sie Kälber- und Kontrollfibroblasten aus mehreren verschiedenen tumorösen Xenotransplantaten.

Danach jede Mischung in die rechten und linken Abschnitte jedes Mäuses einpflanzen. Den Tumor- oder Fibroblasten-Xenotransplantaten 42 Tage nach der Injektion Zeit zum Wachsen lassen. Die Inkubationszeit der Fibroblasten innerhalb des Tumor-Xenotransplantats sollte basierend auf dem Myofibroblasten-Phänotyp optimiert werden, der in den parentalen Fibroblasten im Tumor erworben wird.

Um die Kälber- oder Kontrollfibroblasten aus der euthanasierten Maus zu gewinnen, geben Sie mindestens 0,5 Gramm des Xenotransplantatgewebes und mindestens 0,1 Gramm des Fibroblasten-Xenotransplantatgewebes in separate Schalen. Anschließend zerkleinern Sie das Gewebe mit einem sterilen Rasiermesser in kleine Gewebefragmente von weniger als 1,5 Kubikmillimeter. Überführen Sie dann mithilfe des Rasiermessers die Gewebefragmente in ein 15-Milliliter-Konischgefäß, das den Zelldissoziationspuffer enthält, und wirbeln Sie die Probe eine Minute lang bei maximaler Geschwindigkeit. Inkubieren Sie die Zellsuspension anschließend drei Stunden bei 37 Grad Celsius unter kontinuierlicher langsamer Rühration und zentrifugieren Sie die Zellsuspension.

Die Zellen nach der Zentrifugation fünf Minuten lang bei 250 × g entweder aus Tumor- oder Glasfaserspaltung lösen. Den Zellpellet in PBS resuspendieren und die Zentrifugation wiederholen. Anschließend das resultierende Zellpellet in DMEM resuspendieren, das mit 10 % FCS ergänzt ist, um eine durch Puromycin resistente parentale humane Brustfibroblastenkultur zu isolieren.

Die aus dem Tumor oder den Fibroblasten stammenden Zellen schwimmen in einer 15 cm Petrischale in Gegenwart von einem Mikrogramm pro Milliliter Puramycin bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Dies eliminiert alle kontaminierenden Karzinomzellen und/oder murinen Zellen.

Stromazellen vermehren die Zellen, bis sie konfluent sind, und lagern die Zellen bei minus 80 Grad Celsius in einem Gefriermittel ein. Beachten Sie, dass die resultierenden durch Puromycin resistente Zellen, bezeichnet als 42 Tage alte XP-Kalb-Zelle eins oder Kontrollfibroblasten-Zelle eins, immortell sind und positiv für GFP sind. Menschliche Speicherfibroblasten verstärken ihr tumorförderndes myofibroblastisches Phänotyp innerhalb des Tumor-Xenotransplantats durch Interaktion mit Karzinomzellen während der Tumorprogression. Mischen Sie eine mal 10 hoch 6 MCF-7-RAs-Zellen und drei mal 10 hoch 6 42 Tage alte P-Kalb-Zellen.

Eine Zelle in 400 Mikroliter Kulturmedium mit 50 % Matrigel-Power-Injektion in einem 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen. Bereiten Sie außerdem dreimal 10 hoch 6 42 Tage alte Kontrollfibroblasten-Einzeller ohne Karzinomzellen in einem Eppendorf-Röhrchen vor, um tumorfördernde myofibroblastische Phänotypen der exp-calf-Einzeller weiter zu verstärken. Injizieren Sie ein Gemisch dieser Zellen zusammen mit CF7-RA-Zellen subkutan in eine Nacktmaus. Injizieren Sie außerdem Kontrollfibroblasten-Einzeller allein, ohne Krebszellen, um die Kontrollzellen gegebenenfalls vorzubereiten.

Züchten Sie exp Calf One-Zellen zusätzliche 200 Tage im Tumoxenotransplantat, um exp C Two-Zellen zu erzeugen, um das tumorfördernde myofibroblastische Phänotyp zu verstärken. Erzeugen Sie außerdem Kontroll-Fibroblasten Two-Zellen als Kontrolle gegen exp Calf Two-Zellen, indem Sie Kontroll-Fibroblasten One-Zellen ohne Karzinomzellen in eine Maus injizieren, die Tumoren entfernen und sie in Zellkulturschalen überführen.

Dissezieren und dissociieren Sie das Tumor- oder Fibroblasten-Seno-Transplantat in eine Einzelzell-Suspension und kultivieren Sie die Zellen. Kultivieren Sie die Zellen in einer 15 cm Petrischale mit 10% FCS-DMEM in Gegenwart von Puromycin, bis die Zellen vollständig trypsinisiert sind. Lagern Sie die Zellen anschließend bei minus 80 Grad Celsius in einem Gefriermittel ein. Die resultierenden Puromycin-resistenten Zellen werden als 242 Tage alte exp calf zwei Zellen oder Kontrollfibroblasten zwei Zellen bezeichnet. Die exp calf zwei und Kontrollfibroblasten zwei Zellen, die mit GFP markiert und aus Brusttumor-Xenotransplantaten gewonnen wurden, wurden immunhistochemisch analysiert. Wie in diesem Bild dargestellt, färben sich die Zellen stark positiv für mesenchymale Marker, darunter human-spezifisches Vimentin, Prolyl-4-Hydroxylase, Kollagen Typ I, Fibronectin, S100A4 und Fibroblasten-Oberflächenprotein.

Diese Ergebnisse deuten auf einen humanen Ursprung und mesenchymalen Charakter dieser Zellen hin. Im Gegensatz dazu wurde Zytokeratin, ein Marker für epitheliale Zellen, in diesen GFP-positiven Fibroblasten insgesamt nicht angefärbt. Diese Befunde legen nahe, dass die EXP C zwei- und Kontrollfibroblasten zwei-Zellen von den ursprünglich in murine Xenotransplantate eingebrachten humanen Brustfibroblasten abstammen.

Wichtig ist, dass in XP-Kalb-Zwei-Zellen deutlich mehr Zellen positiv für Alpha-SMA und das extrazelluläre Matrix-Glykoprotein Tenascin C gefärbt wurden, beides Marker für Myofibroblasten im Vergleich zu Kontroll-Fibroblasten-Zwei-Zellen. Beachten Sie, dass ein höherer Anteil an Alpha-SMA-positiven Myofibroblasten in den exp-Kalb-Zwei-Zellen vorhanden ist als in den 42 Tage alten exp-Kalb-Eins-Zellen beobachtet wurde. Diese Daten zeigen, dass residente humane Gedächtnis-Fibroblasten innerhalb von Tumor-Xenotransplantaten während der Tumorprogression nach ihrer Entstehung schrittweise in Kalb-Myofibroblasten übergehen.

Das Komplementationstumor-Xenotransplantat-Modell ebnete Forschern, die am Tumormikromilieu arbeiten, den Weg, um die Prozesse der Entwicklung normaler Fibroblasten zu Krebszellen zu untersuchen. So sagen die Fibroblasten.