Imaging von Estrogen Receptor-α in Rat Pial Arteriolen mit einem Digital-Immunfluoreszenz-Mikroskop

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine einfache Technik zur Optimierung der Färbung und Visualisierung des Östrogenrezeptor-alpha mithilfe von Querschnittsproben von Arterien der Rindenoberfläche zu beschreiben, die aus weiblichen Rattenhirnen gewonnen wurden. Dies wird erreicht, indem zunächst mit Evans-Blau-Farbstoff gefärbte Arterien der Rindenoberfläche von der Hirnoberfläche entfernt und nach der Schnittführung im Kryostaten in acht Mikrometer dicke Ringe geschnitten werden. Die Querschnitte werden auf Objektträger aufgebracht und mit dem primären Antikörper gegen Östrogenrezeptor-alpha inkubiert.

Anschließend werden die Schnitte mit dem sekundären Antikörper und einem Gegenfärbemittel unter Verwendung von Eindeckmedien, die dpi enthalten, inkubiert. Schließlich werden die fluoreszenzmarkierten Gefäßsegmente der Schale abgebildet und mithilfe einer Software für erweiterte Tiefenschärfe in 2D-Bilder umgewandelt. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die mittels eines Nikon-Immunfluoreszenzmikroskops mit Software für erweiterte Tiefenschärfe den östrogenen Rezeptor alpha in Arteriolen der Schale zeigen.

Mein Name ist Dr. Marguerite Littleton Kearney. Heute wird Dr. Neil Farani, ein Postdoktorand in meinem Labor, eine einfache Methode demonstrieren, um die Visualisierung und Färbung des Östrogenrezeptor-alpha in der Haut darzustellen.

Arterien des Rattenhirns, das mit Evans-Blau-Färbung perfundiert und bei minus 70 Grad Celsius gelagert wurde. Mit einem Stereomikroskop die Schalenarterien an der Oberfläche des Gehirns identifizieren und mithilfe feiner Pinzetten entfernen. Dabei vorsichtig anhaftendes Hirngewebe entfernen.

Legen Sie die Arterien in ein kleines Reagenzglas auf Eis. Fixieren Sie die Arterien 30 Minuten lang in 2 % kalter Power-Formaldehyd-Lösung in 0,1 Mol PBS. Um die Arterien für das Schneiden vorzubereiten, geben Sie Einbettmedium auf eine Gefriermatrix, die auf minus 20 Grad Celsius eingestellt ist.

Legen Sie einen Arterienabschnitt flach auf den Chug und warten Sie, bis er gefroren ist. Sobald er fest eingefroren ist, stellen Sie die Arterie aufrecht in Einbettungsmedium auf die Gefriermatrize des Kryostaten. Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Arterie nach vorne zeigt.

Halten Sie die Arterie mit einer Pinzette fest, bis sie vollständig eingefroren ist. Legen Sie die Einfrierplatte mit der Arterie in den Kryostatkopf und schneiden Sie acht Mikrometer dünne arterielle Ringabschnitte direkt auf einen Objektträger. Montieren Sie die arteriellen Schnitte auf Chromkaliumgelatine.

Verschieben Sie die Objektträger mit zwei Pinseln, um die arteriellen Ringe zu richten. Lagern Sie die vorbereiteten Objektträger über Nacht in einer Objektträgerbox im Kühlschrank bei vier Grad Celsius. Nehmen Sie die Objektträger aus dem Kühlschrank und bringen Sie sie auf der Laborbank auf Raumtemperatur.

Spülen Sie die Objektträger mit ein bis 1,5 Milliliter 0,1 molarer PBS. Nach 10 Minuten wird die PBS abgenommen und der Vorgang zweimal wiederholt. Nach dem letzten PBS-Spülschritt inkubieren Sie die Objektträger in einem Milliliter 50 millimolarer Ammoniumchloridlösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur, um die endogene Fluoreszenz zu reduzieren. Spülen Sie die Objektträger anschließend dreimal mit 0,1 molarer PBS, jeweils 10 Minuten pro Spülgang, wie zuvor beschrieben. Danach blockieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang in einer PBS-Lösung, die 0,1 % Triton X-100 und 1 % normales Ziegenserum enthält, um eine unspezifische Bindung des primären Antikörpers zu verringern.

Nach der Blockierung die Objektträger über Nacht bei vier Grad Celsius mit dem primären Antikörper gegen ER-alpha in der Blockierungslösung in einer Verdünnung von 1:500 inkubieren. Die Objektträger aus dem Kühlschrank nehmen und auf Raumtemperatur bringen. Überschüssigen primären Antikörper durch dreimaliges Waschen mit jeweils 1 bis 1,5 Milliliter 0,1 %iger PBS-Lösung für jeweils 10 Minuten entfernen.

Die Objektträger jedes Mal zwei Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur mit dem sekundären Antikörper gegen Kaninchen (Oregon Green 488) in Blockierungslösung inkubieren; nach der Inkubation die Objektträger dreimal für jeweils 10 Minuten in 0,1 molarer PBS waschen und anschließend in eine belüftete Abzugshaube bringen. Einen Tropfen Einbettmedium, der DAPI enthält, auf die Proben geben und danach ein Deckglas darauflegen. Die Ränder des Deckglases mit klarem Nagellack versiegeln und vollständig trocknen lassen.

Legen Sie die vorbereiteten Objektträger mit den gefärbten Rindenstrangsegmenten unter das Mikroskop und stellen Sie es so ein, dass die fluoreszenzmarkierten Bereiche von Interesse sichtbar werden. Die Visualisierung des gefärbten ER-alpha ist der schwierigste Schritt dieses Verfahrens. Suchen Sie die Ebene des geschnittenen Gefäßes mit den klarsten Rezeptoren.

Beginnen Sie mit einer 100-fachen Vergrößerung und erhöhen Sie dann die Vergrößerung auf das 600-fache. Verwenden Sie die Kamera, um Bilder in den Kanälen DPI und ZI für Zellkerne bzw. DR alpha aufzunehmen, und wandeln Sie anschließend mithilfe einer Software mehrere Ansichten von Gefäßsegmenten in 2D-Bilder um. Hier sind die Ergebnisse der immunfluoreszenten Färbung für ER alpha in grün sowie die Gegenfärbung mit DPI dargestellt.

In Blau in einem Schälarterienring, der aus dem Gehirn einer weiblichen Ratte isoliert wurde, deuten die überlagerten Bilder auf das Vorhandensein von intranukleärem Östrogenrezeptor-alpha hin. Durch die Kombination von Zack-Bildern kann ein scharfes Bild der ER-alpha-Immunfluoreszenz erzielt werden; dabei sollten negative Kontrollen zur Berücksichtigung der Autofluoreszenz sowohl für den primären als auch für den sekundären Antikörper durchgeführt werden. Beachten Sie die deutliche Autofluoreszenz entlang der endothelialen Seite einer Arterie, die nicht mit sekundärem Antikörper inkubiert wurde.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie wissen, wie man Arterien von der Gehirnoberfläche isoliert, ablöst und acht Mikrometer dicke Querschnittsringe präpariert. Außerdem sollten Sie mit der Vorgehensweise vertraut sein, den fluoreszenzmarkierten Östrogenrezeptor alpha zu detektieren und die Rezeptoren mithilfe eines digitalen immunfluoreszenzmikroskopischen Verfahrens sowie der Nikon-Software „Extended“ zu visualisieren.