Subretinale Injektion von viralen Vektoren in das retinale Pigmentepithel in einem Mausmodell

Beginnen Sie mit einer betäubten Maus und tragen Sie ein pupillenerweiterndes Mittel auf.

Öffnen Sie unter einem Mikroskop das Augenlid und strecken Sie das Auge leicht hervor, um die Injektionsstelle freizulegen.

Tragen Sie einen Tropfen ophthalmische viskoelastische Lösung auf und legen Sie dann ein Deckglas auf, um die Netzhaut sichtbar zu machen.

Stechen Sie mit einer feinen Nadel ein Loch hinter den Hornhaut-Sklera-Übergang, um Schäden an den Blutgefäßen und der Linse zu vermeiden.

Führen Sie durch dieses vorpunktierte Loch eine stumpfe Spritze tangential in den subretinalen Raum in der Nähe des retinalen Pigmentepithels oder RPE ein, das die Netzhautneuronen stützt.

Injizieren Sie den lentiviralen Vektor, der die Zielgene trägt, in den subretinalen Raum.

Beobachten Sie die Bildung einer subretinalen Blase aufgrund von Flüssigkeitsansammlungen, die die erfolgreiche Vektorabgabe bestätigen.

Schließen Sie vorsichtig das Augenlid, um die Injektionsstelle abzudecken, und lassen Sie die Maus sich erholen.

Das Lentivirus dringt über Endozytose in das RPE ein, setzt sein genetisches Material frei und wandelt es in die entsprechende DNA um, die sich in das Wirtsgenom integriert und so die Genexpression ermöglicht.

Bereiten Sie zunächst eine Mikroliterspritze mit einer stumpfen 33-Gauge-Nadel vor. Sterilisieren Sie es mit Ethylenoxidgas. Als nächstes bereiten Sie eine Verdünnung der viralen Vektoren in PBS in einem Mikrofuge-Röhrchen bei etwa 1 Million Titereinheiten pro Mikroliter vor. Spülen Sie nun beim Befüllen der Spritze diese mehrmals mit der Lösung, um eventuellen Totraum in der Spritze zu entfernen. Halten Sie 1,5 bis 2 Mikroliter für die Injektion bereit.

Nachdem die virale Vektorinjektion vorbereitet ist, betäuben Sie eine erwachsene Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Tiletamin, Zolazepam und Xylazin. Vergewissern Sie sich, dass das Tier betäubt wurde, da keine Reflexe vorhanden sind. Sobald die Anästhesie bestätigt wurde, erweitern Sie die Pupillen mit einem Tropfen von 0,5 % Phenylephrin und 0,5 % Tropicamid. Öffnen Sie nun unter einem Operationsmikroskop das Augenlid und strecken Sie das Auge hervor, um den Äquator freizulegen. Halten Sie das Auge in dieser Position, indem Sie Ihre Finger außerhalb des Orbitalrandes platzieren.

Tragen Sie anschließend eine ophthalmische viskoelastische Lösung auf die Hornhautoberfläche auf und legen Sie einen kleinen runden Deckschieber über die Hornhaut. Somit kann die Netzhaut betrachtet werden. Verwenden Sie nun, etwas posterior des Limbus und untergeordnet im rechten Auge oder oberhalb des linken Auges, eine sterile 30-Gauge-Halbnadel, um ein kleines Loch zu bohren. Vorübergehend oder nasal platzierte Löcher sind keine gute Wahl, da sie schwer abzudecken sind.

Schlagen Sie während der Punktion nicht auf das Limbusgefäß oder die Linse und führen Sie nicht die gesamte Fase der Nadel ein.

Für die subretinalen Injektionen führen Sie die Vektorinjektionsnadel in einem 45-Grad-Winkel zur Irisebene durch das Loch ein. Schieben Sie die Nadel nach hinten in Richtung des peripapillären Bereichs und folgen Sie dem markierten Weg, um die Glaskörperhöhle zu durchqueren. Nähern Sie sich der Nadel in den subretinalen Raum, bis ein leichter Widerstand zu spüren ist, der darauf hinweist, dass die RPE-Schicht erreicht ist.

Dringen Sie nicht mit übermäßigem Druck in das Skleralgewebe ein, da die Nadel möglicherweise im subretinalen Raum platziert werden sollte. Wenn die Nadel das Schädelgewebe mit übermäßiger Kraft durchsticht, dringt sie ohne Widerstand in den extraookularen Orbitalraum ein.

Injizieren Sie nun den viralen Vektor vorsichtig in den subretinalen Raum. Halten Sie die Nadel sehr ruhig, um Gewebeschäden zu vermeiden, was von entscheidender Bedeutung ist. Ziehen Sie dann die Nadel ebenso vorsichtig zurück. Nun kann der Augapfel losgelassen werden. Subretinales Blubbing, das auf eine Vektorakkumulation hinweist, sollte sichtbar sein. Schließen Sie abschließend vorsichtig das Augenlid, um die Injektionsstelle abzudecken. Es kommt zu einer Selbstversiegelung des Lochs.