JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 2:57 Min. • June 18th, 2025
Beginnen Sie mit einer kleinen interferierenden RNA, die die Expression von Prionenproteinen unterdrückt, einem Protein, das mit neurodegenerativen Prionenerkrankungen in Verbindung gebracht wird.
Fügen Sie eine kationische Liposomensuspension hinzu.
Die negativ geladene siRNA bindet an die positiv geladene Liposomenoberfläche.
Einführung des RVG-9r-Peptids, eines Tollwutvirus-Glykoproteins, das an einen Polyarginin-Schwanz gebunden ist.
Die Argininreste erleichtern die RVG-9r-siRNA-Bindung.
Injizieren Sie die Liposomen-siRNA-Peptid-Komplexe in die Schwanzvene einer anästhesierten Maus.
LSPCs zirkulieren durch den Blutkreislauf und erreichen das Gehirn.
Das RVG-9r-Peptid bindet an nikotinische Acetylcholinrezeptoren auf Endothelzellen und löst so eine Rezeptor-vermittelte Transzytose über die Blut-Hirn-Schranke aus.
Im Gehirn bindet RVG-9r an neuronale Acetylcholinrezeptoren und erleichtert so die LSPC-Endozytose und die siRNA-Freisetzung.
Der RNA-induzierte Silencing-Komplex bindet an die siRNA.
Der Passagierstrang dissoziiert, während der Leitstrang an PrP-mRNA bindet und diese spaltet, wodurch die Translation verhindert und die PrP-Expression reduziert wird.
Geben Sie 20 Mikroliter der 4-Nanomol-Liposomensuspension zu 200 Mikrolitern einer 20-Mikromol-Stamm-siRNA-Lösung und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie dann 80 Mikroliter eines 500-Mikromol-Stammes des RVG-9r-Targeting-Peptids zur siRNA-Liposomenlösung und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Nachdem Sie eine Maus mit 2 bis 3 % Isofluoran in Sauerstoff betäubt haben, bedecken Sie die Augen der Maus mit einer Augensalbe und bestätigen Sie die Anästhesie, indem Sie einen Zehenkneifen durchführen. Fahren Sie nur fort, wenn keine Reaktion vorliegt. Platzieren Sie die Maus während der Narkose auf dem Rücken oder auf der Seite, um Zugang zur Schwanzvene zu erhalten.
Wischen Sie den Schwanz mit 70% Ethanol ab und injizieren Sie dann mit einer 26-Gauge-Insulinspritze 300 Mikroliter LSPCs oder PALETS in die Schwanzvene. Beginnen Sie mit der disalen Injektion und bewegen Sie sich proximal, wenn die Vene kollabiert oder reißt. Setzen Sie die Maus in einen sauberen Käfig, bis sie die Brustbeinlage beibehält.