JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Neurowissenschaften
0 Aufrufe • 2:59 Min. • August 7th, 2025
Füllen Sie eine Mikropipette mit einer DNA-Mischung, die Plasmidvektoren enthält, die das interessierende Gen tragen, und einen Tracking-Farbstoff. Sichern Sie es in einem Mikromanipulator.
Positionieren Sie einen Agaroseblock unter dem Mikroskop und platzieren Sie einen in Agarose eingebetteten embryonalen Hirnschnitt der Maus mit kortikalen Interneuronen darüber.
Senken Sie die Mikropipette ab und injizieren Sie das DNA-Gemisch in die Vorläuferregion des Interneurons. Der Tracking-Farbstoff markiert die Injektionsstelle.
Positionieren Sie einen weiteren Agaroseblock auf einer Petrischalenelektrode und eine Agarosesäule auf der Deckelektrode.
Übertragen Sie die Scheibe auf den Block und richten Sie die Deckelektrode über der Injektionsstelle aus.
Wenden Sie kurze elektrische Impulse an, um die Zellmembranen vorübergehend zu permeabilisieren, so dass die Plasmide in den Zellkern eindringen können.
Inkubieren Sie die Scheibe in einem Medium, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.
Im Zellkern löst das Plasmid die Genexpression aus, produziert das Zielprotein und moduliert die Vorläuferfunktionen der Interneuronen.
Für die Injektion mischen Sie die Expressions- und Kontrollvektor-DNA in einer Konzentration von 1 Mikrogramm pro Mikroliter für jeden Vektor und fügen Sie schnelle grüne Stammlösung in einer Verdünnung von 1 bis 10 hinzu. Füllen Sie eine gezogene Glasmikropipette mit einem Innendurchmesser von 0,5 Millimetern und einem Außendurchmesser von 1 Millimeter mit 10 Mikrolitern der DNA-Mischung und laden Sie die Mikropipette in einen pneumatischen Pico-Pumpeninjektor. Legen Sie den größeren Agaroseblock unter ein Stereomikroskop und platzieren Sie die zu injizierende Scheibe auf dem Agarosestück.
Injizieren Sie dann 25 bis 50 Nanoliter Volumen in die ausgewählte mediale ganglionäre oder kaudale ganglionäre Eminenzregion der Schnitte. Unmittelbar nach der Injektion legen Sie den kleinen Agaroseblock auf die Petrischalenelektrode und befestigen Sie die Agarosesäule mit einem flachen Mikrospatel an der mobilen Abdeckelektrode.
Übertragen Sie die injizierte Scheibe mit ihrer Stützmembran auf den Agaroseblock und platzieren Sie die obere Elektrode mit der Agarosesäule auf dem ausgewählten Bereich der Scheibe. Dann galvanisieren Sie den Bereich mit zwei 5-Millisekunden-Impulsen von 125 Volt im Abstand von 500 Millisekunden. Legen Sie nach der Elektroporation die Scheibe mit ihrer Stützmembran wieder in ihre Halteschale und stellen Sie die Schale wieder in den Gewebekultur-Inkubator.