JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 2:44 Min. • August 7th, 2025
Beginnen Sie mit einer fixierten Wirbelsäulen- und bulbären Muskelatrophie oder einer von SBMA betroffenen Maus.
Reinige den Schwanz und erwärme ihn, um die Vene zu erweitern.
SBMA wird durch einen mutierten Androgenrezeptor oder AR-Gen verursacht, der mutierte AR-mRNA produziert.
Diese mRNA synthetisiert in Motoneuronen toxische Proteine, die die Signalübertragung beeinträchtigen und zu Muskelschwäche führen.
Nehmen Sie als Nächstes eine Spritze mit rekombinanten Adeno-assoziierten Virus- oder AAV-Vektoren mit einem Plasmid, das für therapeutische microRNA kodiert.
Führen Sie die Nadel in die Schwanzvene ein und injizieren Sie die Lösung.
Üben Sie nun Druck aus, um die Blutung zu stoppen, und setzen Sie die Maus dann wieder in ihren Käfig ein.
Sobald der virale Vektor im Umlauf ist, erreicht er Motoneuronen, die die Muskelfunktion steuern.
Das Virus dringt über die Endozytose in die Zelle ein und setzt das Plasmid frei.
Das Plasmid produziert reife microRNA mit komplementären Sequenzen zur mutierten AR-mRNA.
Diese microRNAs binden an AR-mRNAs und lösen deren Abbau aus.
Dies hemmt die Ansammlung toxischer Proteine und hilft, die neuromuskuläre Funktion zu verbessern.
Teilen Sie den AAV-microRNA-Plasmidbestand in 100 bis 200 Mikroliter große Aliquote auf, die eine Viruslast von 10 bis 100 Billionen Genomen pro Milliliter enthalten. Laden Sie dann ein Aliquot in eine Spritze und befestigen Sie eine Nadel von 27 bis 30 Gauge.
Befestigen Sie nun eine Maus mit einem Standard-Maus-Rückhaltesystem mit freiliegendem Schwanz. Reinigen Sie dann den Schwanz mit 70% Alkohol und legen Sie ein warmes Pad etwa 30 Sekunden lang unter den Schwanz, um die Vasodilatation zu erhöhen. Führen Sie nun am distalen Teil des Schwanzes die Nadel mit der Abschrägung nach oben und in einem flachen Winkel von etwa 15 Grad in die Schwanzvene ein.
Injizieren Sie dann das Virus und warten Sie einige Sekunden, bevor Sie die Nadel entfernen. Nachdem Sie die Nadel entfernt haben, üben Sie mit zwei Fingern mäßigen Druck aus, um Blutungen zu stoppen. Setzen Sie das Tier dann in seinen Heimatkäfig zurück.