JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurowissenschaften
0 Ansichten • 3:00 Min. • June 17th, 2025
Nehmen Sie ein chemisch fixiertes Maushirnschnitt in einer Multiwell-Platte.
Das Gewebe enthält Axone, die von lipidreichen Myelinscheiden umgeben sind. Die Zellkörper enthalten Nissl-Körperchen, die aus dem rauen endoplasmatischen Retikulum und Ribosomen bestehen.
Inkubieren Sie in einer Permeabilisierungslösung, die einen fluoreszierenden Nissl-Farbstoff enthält. Die Lösung permeabilisiert die Zellmembranen, so dass der Farbstoff an die ribosomale RNA in den Nissl-Körpern binden und die Zellkörper markieren kann.
Legen Sie das Gewebe unter ein konfokales Mikroskop mit einem kohärenten Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie-System (CARS).
Direkt synchronisierte Pump- und Stokes-Laserstrahlen auf das Gewebe, die darauf abgestimmt sind, molekulare Bindungen in der lipidreichen Myelinscheide anzuregen.
Führen Sie einen Sondenlaserstrahl ein, um mit den angeregten Bindungen zu interagieren und ein Anti-Stokes-Signal zu erzeugen, das spezifisch für Myelin ist.
Ein Photodetektor fängt das Signal ein, um ein myelinspezifisches Bild zu erzeugen.
Verwenden Sie die konfokale Bildgebung, um Signale von den beschrifteten Nissl-Körpern zu erfassen.
Überlagern Sie die konfokalen und CARS-Bilder zur Visualisierung der neuronalen Architektur.
Nach der Präparation der Gewebe, wie im Manuskript beschrieben, färben Sie frei schwebende Schnitte für Nissl und Antikörpermedien, um Zellkörper sichtbar zu machen. Inkubieren Sie die Schnitte dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Standard-Laborschüttler. Bevor Sie die Proben zum Mikroskop bringen, schalten Sie den CARS-Laser ein und wärmen Sie ihn mindestens eine Stunde lang auf. Richten Sie dann den CARS-Laser aus, indem Sie die Pumpen- und Stokes-Laserstrahlen räumlich überlappen, und stellen Sie die Verzögerung zwischen den beiden Laserstrahlen ein.
Kohler die Kondensoroptik und die Blende des Mikroskops für die CARS-Bildgebung. Stellen Sie dann das externe Periskop so ein, dass die beiden räumlich überlappenden Laser auf den Scankopfspiegeln des Mikroskops zentriert werden. Um eine optimale Erkennung von nicht degescannten CARS zu erzielen, stellen Sie sicher, dass der Kondensator korrumpiert ist.
Für die konfokale Immunfluoreszenzbildgebung und die CARS-Bildgebung können Sie den CARS-Laser sowohl mit Vorwärts- als auch mit epi-CARS-Detektoren ausstatten, indem Sie ein konfokales Mikroskop integrieren, das mit sichtbaren Lasern für die Fluoreszenzbildgebung ausgestattet ist. Legen Sie nun die Schnitte in eine Kulturschale mit Deckglasboden und PBS, um ein Austrocknen des Gewebes zu vermeiden. Verwenden Sie außerdem ein Glasgewicht, um das Taschentuch in der Nähe des Deckglases zu halten.
Über die grafische Benutzeroberfläche. Legen Sie die Bildaufnahmeparameter für die konfokale Fluoreszenzbildgebung CARS und Nissl fest. Legen Sie die Probe auf den Mikroskoptisch. Fokussieren Sie die Probe und nehmen Sie die Bilder auf.