Bildgebung der Kalziumdynamik in Seitenlinien-Haarzellen von Zebrafischlarven

Nehmen wir eine gelähmte transgene Zebrafischlarve, die in einer Perfusionskammer sitzt.

Die Larve exprimiert membranlokalisierte Kalziumindikatoren in den Haarzellen des Neuromastes, einer Komponente des Seitenliniensystems, das Wasserbewegungen erkennt.

Die Haarzellen bestehen aus apikalen Haarbündeln und basalen präsynaptischen Regionen, die Synapsen mit afferenten Neuronen bilden, um Signale zu übertragen.

Positionieren Sie unter einem Konfokalmikroskop mit geringer Vergrößerung eine Flüssigkeitsstrahlpipette in der Nähe der Larve.

Erhöhen Sie die Vergrößerung, um einen Neuromast zu lokalisieren, positionieren Sie die Pipette in seiner Nähe neu und wechseln Sie zur

Fluoreszenzbildgebung.

Liefern Sie Flüssigkeitsimpulse, um Haarbündel abzulenken und Mechanotransduktionskanäle für den apikalen Kationenstrom, einschließlich Kalziumionen, zu öffnen.

Schwach fluoreszierende Indikatoren binden an Kalzium, was zu einem lokalen Anstieg der Fluoreszenz führt.

Der Kationeneinstrom depolarisiert die Zelle und löst den Kalziumeintritt durch spannungsgesteuerte Kanäle an der basalen Präsynapse aus, wo es an die Indikatoren bindet und die Fluoreszenz lokal erhöht.

Visualisieren Sie die apikale und basale Calciumdynamik in Echtzeit.

Bei diesem Verfahren werden 10 Mikroliter neuronaler Puffer mit einer Gelladespitze in eine ordnungsgemäß gebrochene Flüssigkeitsstrahlnadel zurückgefüllt. Laden Sie die Lösung gleichmäßig und blasenfrei bis zur Spitze. Führen Sie dann die Nadel in den Pipettenhalter ein, der am motorisierten Mikromanipulator befestigt ist.

Setzen Sie die Perfusionskammer in einen kreisförmigen Kammeradapter auf dem Mikroskoptisch ein. Bewegen Sie den motorisierten Tisch so, dass sich die Larve in der Mitte des Sichtfeldes befindet. Drehen Sie anschließend den Kreiskammeradapter so, dass die A-P-Achse der Larve ungefähr mit der Flugbahn der Fluidstrahlnadel ausgerichtet ist.

Bringen Sie die Larve mit Durchlicht und differentiellem Interferenzkontrast in den Fokus und zentrieren Sie sie unter dem 10-fach-Objektiv. Heben Sie dann das 10-fache Ziel an. Bringen Sie die Flüssigkeitsstrahlnadel mit dem motorisierten Mikromanipulator in die Mitte des Sichtfeldes, so dass sie vom übertragenen Licht beleuchtet wird und den neuronalen Puffer kaum berührt.

Senken Sie das 10-fache Ziel, um sich auf die Larve zu konzentrieren und ihren Standort zu bestätigen. Fokussieren Sie das Objektiv auf die Fluidstrahlnadel. Bewegen Sie die Fluidstrahlnadel mit dem Mikromanipulator in der x- und y-Achse, bis sie parallel zur dorsalen Seite der Larve positioniert ist.

Konzentriere dich danach wieder auf die Larve. Bringen Sie die Nadel in der z-Achse nach unten und positionieren Sie die Nadel entlang der Rückenseite des Fisches, 1 Millimeter vom Körper entfernt. Bewegen Sie den Kreiskammeradapter vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Flüssigkeitsstrahlnadel entlang der A-P-Mittellinie der Larve ausgerichtet ist.

Wechsle als Nächstes zum 60x Wasserobjektiv. Stellen Sie sicher, dass das Objektiv in den neuronalen Puffer eingetaucht ist. Verwenden Sie den Feinfokus, um einen Neuromast zu lokalisieren. Bewegen Sie anschließend den motorisierten Tisch, um den interessierenden Neuromast in der Mitte des Sichtfelds zu platzieren.

Halten Sie die Spitze der Fluidstrahlnadel entlang der Rückenseite des Fisches. Berühren Sie die Spitze der Flüssigkeitsstrahlnadel nicht mit der Larve oder der Kammeroberfläche. Positionieren Sie die Fluidstrahlnadel mit dem Mikromanipulator so, dass sie 100 Mikrometer von der Außenkante des Neuromastes entfernt ist.

Fokussieren Sie sich dann bis zu den Spitzen der apikalen Haarbündel. Die Unterseite der Fluidstrahlnadel sollte in dieser Ebene scharf sein. Stellen Sie die Hochgeschwindigkeits-Druckklemme vom manuellen in den externen Modus, um Eingaben von der Bildgebungssoftware zu erhalten. Stellen Sie die Hochgeschwindigkeits-Druckklemme durch Drücken der Nulltaste auf Null und stellen Sie mit dem Sollwertknopf den Ruhedruck leicht positiv ein. Bestätigen Sie den Ruheausgang der Hochgeschwindigkeits-Druckzange mit einem PSI-Manometer, das an den Ausgang der Kopfstufe angeschlossen ist.

Um den Druck zu bestimmen, der zur Stimulation der Haarbündel erforderlich ist, wenden Sie einen Testreiz mit einem Ausgang von 0,125 und 0,25 Volt für 200 bis 500 Millisekunden an. Messen Sie für jeden Testreiz den Ablenkungsweg der Spitzen der Haarbündel (der Kinozilien). Wählen Sie einen Druck, der die Bündel über eine Strecke von ca. 5 Mikrometern bewegt. Achten Sie darauf, dass die Spitzen der Kinozilien die ganze Zeit im Fokus bleiben.

Um Bilder mit einer einzelnen Ebene aufzunehmen, wählen Sie einen Stimulus aus, der während der 80-Frame-Aufnahme nach Frame 30 nach drei Sekunden abgegeben werden soll. Um mechanosensitive Kalziumreaktionen zu messen, konzentrieren Sie sich auf die Basis der apikalen Haarbündel und beginnen Sie mit der Bildaufnahme. Um präsynaptische Kalziumreaktionen zu messen, fokussieren Sie sich auf die Basis der Haarzellen und beginnen Sie mit der Bildaufnahme.