Spontane Kalzium-Bildgebung für kompartimentspezifische Dynamik in Astrozyten

Nehmen Sie ein polymerbeschichtetes Deckglas, das eine Neuron-Astrozyten-Mischkultur in der Aufnahmekammer enthält.

Diese transfizierten Zellen exprimieren kalziumempfindliche Proteine auf den Plasma- und ER-Membranen, die bei Kalziumbindung fluoreszieren, um die subzelluläre Kalziumdynamik zu verfolgen.

Fügen Sie Medien hinzu, die Kalziumionen enthalten, und decken Sie die Kammer ab, um eine Verdunstung zu verhindern.

Stellen Sie die Kammer unter ein Fluoreszenzmikroskop.

Calcium-Ionen binden an calciumempfindliche Proteine. Bei Bestrahlung mit blauem Licht fluoreszieren die kalziumempfindlichen Proteine auf der ER-Außenmembran grün. Verwenden Sie diese grüne Fluoreszenz, um Astrozyten zu lokalisieren.

Bestrahlen Sie anschließend mit grünem Licht. Die kalziumempfindlichen Proteine auf der Plasmamembran fluoreszieren rot. Bestätigen Sie das Vorhandensein von roter Fluoreszenz in demselben Astrozyten, der grüne Fluoreszenz aufweist.

Nehmen Sie Zeitrafferbilder von kalziumempfindlichen Proteinen auf der Plasmamembran auf, gefolgt von den kalziumempfindlichen Proteinen auf der ER-Außenmembran.

Analysieren Sie die Bilder, um die kompartimentspezifische spontane Kalziumaktivität in den ausgewählten Astrozyten zu beobachten.

Montieren Sie das Deckglas mit den mit Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f transfizierten Zellen in die Aufnahmekammer des Mikroskops. Fügen Sie 400 Mikroliter des Bildgebungsmediums hinzu und legen Sie einen Deckel auf die Kammer. Wählen Sie das Filterset für GCaMP6f und die Lichtquelle. Lokalisieren Sie die Astrozyten, die OER-GCaMP6f exprimieren.

Wählen Sie als Nächstes ein Filterset und eine Lichtquelle für RCaMP2 aus. Und bestätigen Sie, ob Lck-RCaMP2 in denselben Astrozyten exprimiert wird. Nehmen Sie Zeitrafferbilder von Lck-RCaMP2 bei 2 Hertz für zwei Minuten auf und speichern Sie die Bilddaten.

Danach wird der Filter wieder auf den für GCaMP6f gesetzt. Nehmen Sie zwei Minuten lang Zeitrafferbilder von OER-GCaMP6f bei 2 Hertz auf. Speichern Sie anschließend die Bilddaten.