Name: Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Erfahren Sie die effiziente Ableitung von Kardiomyozyten aus humanen embryonalen Stammzellen mittels Small-Molecule-Induktion mit Nicotinamid. Diese Methode ermöglicht die gezielte Generierung funktioneller Herzzellen für kardiovaskuläre Forschung.

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XHP wurde von National Institute of Health (NIH) Zuschüsse aus National Institute on Aging (NIHK01AG024496) und The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NIHR21HD056530) unterstützt.

1. Lösungs-und Medien-Vorbereitung <ol><li> Gelatin Beschichtungslösung: 0,1% (w / v) Gelatine in ddH 2 O, autoklaviert und bei 4 ° C. </li><li> Matrigel Beschichtungslösungen. Stammlösung: langsam auftauen Matrigel (10 ml) bei 4 ° C über Nacht, 10 ml eiskaltem DMEM oder DMEM/F12, gut mischen und aliquoten 1 ml / Rohr unter sterilisiert Gewebekultur Kapuze, lagern bei -20 ° C. Working-Lösung: langsam auftauen 1 ml Matrigel Aliquot bei 4 ° C für 1-2 Stunden, Transfer zum 14 ml gekühltes DMEM oder DMEM/F12 und gut mischen unter sterilisiert Gewebekultur Haube unmittelbar vor der Beschichtung. </li><li> Menschliche Laminin Beschichtungslösung: Verdünnen Sie 1 ml menschlichen Laminin-Lösung (0,5 mg / ml in Tris Buffered NaCl, Lagerung bei -80 ° C, langsam auftauen bei 4 ° C für 1-2 Stunden) mit eiskaltem DMEM oder DMEM/F12 zu 12,5 ml Arbeitslösung (40 ug / ml) unter sterilisiert Gewebekultur Haube unmittelbar vor der Beschichtung. </li><li> Wachstumsfaktor Stammlösungen (500-1000X): Man löst growth factor bei 10 ug/ Ml in sterilisierte Puffer (0,5% BSA, 1,0 mM DTT, 10% Glycerin, 1XPBS) und speichern als 50-100 &amp;mgr; l / Röhrchen aliquotiert bei -80 ° C. </li><li> HESC Medien: DMEM/F12 oder KO-DMEM (80%), KO Serumersatz (20%), L-Alanyl-L-Gln oder L-Gln (2 mM), MEM nicht essentielle Aminosäuren (MNAA, 1X) und β-Mercaptoethanol (100 uM), filtriert und bei 4 ° C mit 20 ng / ml bFGF vor der Verwendung ergänzt. Oder ersetzen Sie "KO-Serum-Ersatz" mit definierten Komponenten: DMEM/F12 oder KO-DMEM (100%), L-Alanyl-L-Gln oder L-Gln (2 mM), MNAA (1X), MEM essentiellen Aminosäuren (MEAA , 1X) und β-Mercaptoethanol (100 uM), filtriert und bei 4 ° C, mit bFGF (20 ng / ml) ergänzt, Humaninsulin (20 ug / ml), Ascorbinsäure (50 ug / ml), die menschliche Aktivin A (50 ng / ml), Humanalbumin / Albumax (10 mg / ml), und menschliches Transferrin (8 pg / ml) vor der Verwendung. </li><li> HESC kardialen Differenzierung Medien: DMEM/F12 (90%), definiert FBS (10%) und L-Alanyl-L-Gln oder L-Gln (2 mM). </li><li> Medien mit Nicotinamid (NAM): add NUhr bis HESC Medien oder HESC kardialen Differenzierung Medien Endkonzentration von 10 mM, gefiltert, lagern bei 4 ° C und innerhalb von 2 Wochen der Vorbereitung. </li></ol> 2. Plattenbeschichtung <ol><li> Coat-Platten mit Gelatine: 2,5 ml / well der Gelatine-Lösung bis 6-Well-Platten und Inkubation über Nacht bei 37 ° C befeuchteten Inkubator. </li><li> Coat-Platten mit Laminin: chill Gelatine beschichteten Platten und entfernen Gelatine, 2,5 ml / well Matrigel oder menschliche Laminin-Beschichtung funktionierende Lösung zu vorgekühlte verkleistert 6-Well-Platten und Inkubation bei 4 ° C über Nacht. </li></ol> 3. Passagieren und Seeding Undifferenzierte hESCs unter definierten Bedingungen <ol><li> Lassen hESC Kolonien wachsen auf 5-7 Tage alt, und nehmen Sie hESC Kultur Platte Präpariermikroskop (pre-warm Sezieren der Bühne bis 37 ° C) unter Sezieren sterilisiert Kapuze. </li><li> Wählen Sie hESC Kolonien aufgeteilt werden. Morphologisch sind diese Kolonien&gt; 75% undifferenzierte hES (smalle Kompakt-Zellen), in der Regel leicht opak (nicht weißen aufgehäuften Zellen nicht klar differenzierten Zellen) mit definierten Rand unter dem Binokular. Vorsichtig einen Überblick über die ausgewählten Kolonien und entfernen differenzierten Fibroblasten-Schicht rund um die Kolonie und alle differenzierten Teile (falls vorhanden) der Kolonie mit der Schärfe des P2 sterilen Pipettenspitze gezogen oder Glaskapillare. </li><li> Entfernen Sie die alten Medien mit schwimmenden freistehende differenzierten Zellen durch Absaugen. Waschen mit hESC Medien (ohne bFGF) einmal. 3 ml / well frisches hESC Medien mit 20 ng / ml bFGF. </li><li> Schneiden Sie die undifferenzierte hES-Kolonien in kleine Stücke, und lösen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze gezogen oder Glaskapillare. </li><li> Pool der Medien, die losgelöst Kolonie Stücke zusammen in einem 50 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie die Platte einmal mit 1 ml / well hESC Medien mit 20 ng / ml bFGF und Pool zusammen. </li><li> Saugen Sie das Matrigel oder menschliche Laminin-Lösung von dem beschichteten frischen Platten. Aliquot 4 ml / well hESC-haltigen Medien Kolonie Stücke zu einer 6-Well-Platte. Gently Transfer der Platte Inkubator ohne Schütteln und lassen Kolonie Stücke Samen über Nacht, ohne zu stören in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2. </li></ol> 4. Cardiac Induktion von hESCs unter definierten Kultur-System mit Nicotinamid <ol><li> Am Tag 3 nach der Aussaat, die Abschaffung der meisten alten Medien aus jedem Well der Platte und lassen genug Medien zu ermöglichen hESC Kolonien unter Wasser (niemals zulassen hESCs austrocknen) werden. Ersetzen mit 4 ml / well frisches hESC Medien mit 20 ng / ml bFGF und 10 mM Nicotinamid (NAM). </li><li> Ersetzen Sie die alten Medien mit frischen hESC Medien mit 20 ng / ml bFGF und 10 mM NAM jeden zweiten Tag, und lassen Sie Herz-induzierten embryonalen Stammzellen Kolonien wachsen zu Tag 8-10. Nach Belichtung mit NAM, werden alle Zellen innerhalb der Kolonie zu unterziehen Morphologie Änderungen an großen differenzierten Zellen, die auch weiterhin vermehren wird. Die Kolonien werden in Größe und von Tag 8-10 zu erhöhen, eind-Zellen beginnen, häufen sich in einigen Gebieten der Kolonien. </li></ol> 5. Continuing Cardiac Differenzierung in Suspensionskultur <ol><li> Nehmen hESC Kultur Platte Präpariermikroskop (pre-warm Sezieren der Bühne bis 37 ° C) unter Sezieren sterilisiert Kapuze. Vorsichtig einen Überblick über die Kolonien und entfernen Fibroblasten-Schicht rund um die Kolonie (differenzierte Zellen aus der Kolonie eingewandert) mit dem Rand des P2 sterilen Pipettenspitze gezogen oder Glaskapillare. </li><li> Entfernen Sie die alten Medien mit schwimmenden freistehende Fibroblasten-Zellen durch Absaugen. Waschen mit hESC Medien (ohne bFGF) einmal. 3 ml / well frisches hESC Medien (ohne bFGF). </li><li> Schneiden Sie das Herz-induzierten embryonalen Stammzellen Kolonien in kleine Stücke, und lösen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze gezogen oder Glaskapillare. </li><li> Pool der Medien, die losgelöst Kolonie Stücke zusammen in einem 50 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie die Platte einmal mit 1 ml / well hESC Medien (ohne bFGF) und Pool zusammen. </li><li> Aliquot 4 ml / well serumfreiem hESC Medien mit Kolonie Stücke zu einer 6-well ultraniedrigen Befestigungsplatte und inkubieren bei 37 ° C befeuchteten Inkubator, damit schwimmende zellulären Clustern (Kardioblasten) für 4-5 Tage zu bilden. </li></ol> 6. Beating Cardiomyocyte Phänotyp Reifung in Adhesive Kultur <ol><li> Pool der Medien mit schwimmenden Kardioblasten zusammen in einem 50 ml konischen Röhrchen. Zentrifugation bei 1400 rpm für 5 min. Saugen Sie die alten Medien so viel wie du kannst, und fügen Sie die gleiche Menge frischen hESC kardialen Differenzierung Medien mit 10 mM NAM. </li><li> Pipette auf und ab zu schweben Kardioblasten und aliquoten 4 ml / well bis 6-Well-Platten mischen. Übertragen Sie die Platten auf eine 37 ° C befeuchteten Inkubator, damit Kardioblasten zu befestigen Nacht. </li><li> Ersetzen hESC kardialen Differenzierung Medien mit 10 mM NAM jeden zweiten Tag. </li><li> Am Tag 8, mit menschlichen embryonalen Stammzellen Herz-Differenzierung Medien ohne NAM ersetzen und weiterhin HESC kardialen Differenzierung media e ersetzensehr anderen Tag. Beating Kardiomyozyten beginnen, in ca. 1-2 Wochen kontinuierlicher Kultivierung nach Abzug der NAM erscheinen und der Erhöhung der Zahl mit der Zeit und konnte starke und rhythmische Kontraktionen länger als 3 Monate behalten. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: Nicotinamid (NAM) wiedergegeben wird ausreichen, um hESCs in den definierten Kultur-System zum Übergang erhalten von Pluripotenz ausschließlich auf eine cardiomesodermal Phänotyp (Abb. 2B) zu induzieren. Bei der Belichtung von undifferenzierten hES zu NAM, werden alle Zellen innerhalb der Kolonie zu unterziehen Morphologie Änderungen an großen differenzierten Zellen, die nach unten regulieren die Expression von Oct-4 und beginnen, die Herz-spezifische Transkriptionsfaktor (CSX) Nkx2.5 und α-express actinin, im Einklang mit einer cardiomesoderm Phänotyp (Abb. 2B). Diese differenzierten Zellen weiter zu vermehren und die Kolonien an Größe zunehmen. Erhöhte Intensität des Nkx2.5 wirdin der Regel in den Gebieten der Kolonien, in denen Zellen beginnen zu häufen (Abb. 2B) beobachtet werden. Nach abgelöst, wird die NAM-behandelten hESCs schwimmenden zellulären Clustern (Kardioblasten) in einer Suspensionskultur Form der kardialen Differenzierung fortzusetzen. Nach erlaubt die Kardioblasten zu befestigen und die weitere Zusammenarbeit mit NAM für 1 Woche zu behandeln, wird gegen Kardiomyozyten beginnen, in ca. 1-2 Wochen kontinuierlicher Kultivierung nach Abzug der NAM erscheinen mit einer drastischen Steigerung der Effizienz als die spontane multi-lineage Differenzierung gegenüber hESCs ohne Behandlung über den gleichen Zeitraum (Abb. 2C). Zellen innerhalb des Kardiomyozyten schlagen Cluster Express Marker Merkmal Kardiomyozyten, einschließlich Nkx2.5 und α-Actinin (Abb. 2C). Die Kontraktionen des schlagenden Kardiomyozyten wurden durch elektrische Profile bestätigt, stark zu sein, rhythmische, gut koordinierte und gut mitgerissen, mit regelmäßigen Impulsen erinnert an die p-QRS-T-Komplexe von Körperoberfläche Elektroden in klinischen Elektrokardiogramme gesehen (Abb. 2C, siehe auch Video). Die Kardiomyozyten könnte behalten ihre starke Kontraktilität über 3 Monate. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Insgesamt Systeme der konventionelle Ansatz im Vergleich zu kleinmolekularen-Induktion Ansatz zur Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen zu spezialisierten funktionalen Zellen. (A) Eine schematische Darstellung der konventionelle Ansatz mit multi-lineage Neigung der menschlichen pluripotenten Stammzellen durch spontane Keimblatt Differenzierung. (B) Eine schematische Darstellung gut kontrollierten effiziente Induktion von menschlichen pluripotenten Stammzellen ausschließlich zu einem bestimmten klinisch relevanten Linie durch eine einfache Bereitstellung von kleinen Molekülen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3274/3274fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Nicotinamide induziert kardiale Linienspezifikation direkten der Pluripotenz unter definierten Bedingungen und die Progression in Richtung schlagen Kardiomyozyten. (A) Schematische Darstellung des Protokolls Zeit Linie gerichtet kardialen Differenzierung von hES. (B) Bei der Belichtung von undifferenzierten hES zu Nicotinamid (NAM) unter den definierten Kultur, großer differenzierte Oct-4 (rot)-negativen Zellen innerhalb der Kolonie begann zu entstehen, wie zum Spott behandelt (DMSO) hESCs als Kontrollgruppe verglichen. NAM-induzierte Oct-4-negativen Zellen begannen sich zu äußern Nkx2.5 (grün) und α-Actinin (rot), im Einklang mit frühen kardialen Differenzierung. Schrittweise erhöhte Intensität der Nkx2.5 war in der Regel in Gebieten der Kolonie, wo Zellen begannen sich zu häufen beobachtet. Alle Zellen sind durch DAPI-Färbung ihrer Kerne (blau) angezeigt. (C) NAM-induzierte kardiale-committed hESCs ergab schlagen Kardiomyozyten mit einer drastischen Steigerung der Effizienz, wie sie in der zellulären Clustern bewertetter, die rhythmische Kontraktionen (siehe elektrophysiologische Profil und Videos) und immunpositive für Nkx2.5 (grün) und α-Actinin (rot) angezeigt. Phase Bilder Vertreter großer schlagen Kardiomyozyten Clustern und höhere Macht Bilder von repräsentativen Contracting Herzmuskulatur sind gezeigt (siehe auch entsprechende Videos). Die Pfeile zeigen die großen Schläge Kardiomyozyten Cluster für die elektrophysiologische Ableitung verwendet. Elektrophysiologische Profil des schlagenden Kardiomyozyten zeigt regelmäßig, mitgerissen, rhythmische Impulse erinnert an die p-QRS-T-Komplexe in der klinischen Elektrokardiogramme gesehen. Maßstabsbalken: 0,1 mm. Videos: Contracting Kardiomyozyten aus NAM-induzierte hESCs differenziert. Videos 1 und 2 zeigen repräsentative große Schläge Kardiomyozyten Cluster in etwa 1 und 3 Monate nach der Befestigung. Video 3 und 4 zeigen repräsentative öffentliche Herzmuskeln bei höherer Leistung. Video 5 zeigt eine typical kleine Schläge Kardiomyozyten Cluster spontan aus hESCs ohne NAM Behandlung als Kontrolle unterschieden. <a href="/files/ftp_upload/3274/3274video1.avi">Klicken Sie hier, um Video 1 zu sehen.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video2.avi">Klicken Sie hier, um Video 2 zu sehen.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video3.avi">Klicken Sie hier, um Video 3 zu sehen.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video4.avi">Klicken Sie hier, um Video 4 zu sehen.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3274/3274video5.avi">Klicken Sie hier, um Video 5 zu sehen.</a>

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</ol>

Die Autoren erklären, konkurrierende Interessen. XHP ist der Gründer der Xcelthera. XHP und EYS haben geistigem Eigentum im Zusammenhang mit hESCs.

Eine der großen Herausforderungen für Entwicklungs-Studie und klinische Umsetzung wurde, wie die breite Differenzierungspotential von pluripotenten menschlichen Stammzellen zu einem gewünschten Phänotyp effizient und vorhersagbar Kanal. Obwohl diese Zellen spontan differenzieren können in vitro in Zellen aller Keimblätter, indem Sie durch ein Multi-Linie aggregierten Stufe, in hESC-derived multi-lineage Aggregate (Embryoidkörpern), nur ein sehr kleiner Teil der Zellen (&lt;2%) spontan Differenzierung in Herzmuskelzellen 13-15 (Abb. 1A). Nach Immunselektion wurden die angereicherte Populationen von Herzmuskelzellen in der Lage, als biologische Schrittmacher-Funktion, um die Funktion eines beschädigten Herzmuskels mechanisch und elektronisch Rettung nach der Injektion in das Herz von Tiermodellen 13. In Nagetiere Infarkt Modelle wurden eingepflanzt hESC-derived kardiale Nachkommen überleben können und reifen bis zu 12 Wochen, und teilweise remuscularize den verletzten Herzen und zur Verbesserung der kontraktilen Funktion 14,15. Allerdings haben die Ineffizienz bei der Erzeugung von menschlichen Herz-verpflichtet-Zellen durch multi-lineage Differenzierung von pluripotenten Zellen und das hohe Risiko der Tumorigenität nach der Transplantation weitere klinische Übersetzung behindert. Entwicklung von Strategien, die breite Differenzierungspotential von pluripotenten hES ausschließlich und vorhersagbar Kanal zu einem kardialen Phänotyp ist entscheidend für die Nutzung der Kraft der hESC Biologie im Herzen Feld. Um einheitlich Umwandlung von menschlichen pluripotenten Stammzellen zu einer bestimmten Linie zu erreichen, verwendeten wir eine definierte Kultur System in der Lage für die Versicherung der Proliferation von undifferenzierten hES, die Bedingungen für gut kontrollierte effiziente Induktion von pluripotenten hES ausschließlich zu identifizieren, um eine bestimmte klinisch relevante Linie durch einfache Bereitstellung von kleinen Molekülen (Abb. 1B). Wir fanden, dass Nicotinamid induzierten Herz-Linie Engagement direkt bei pluripotent hESCs unter definierten Kultur, die weiter fortgeschritten zu schlagen Kardiomyozyten mit hohem Wirkungsgrad (Abb. 2). Nkx2.5 ist ein evolutionär konservierter homeobox Transkriptionsfaktor für normale kardiale Entwicklung und Mutationen des Gens unerlässlich sind mit menschlichen angeborenen Herzkrankheit (KHK), der häufigsten menschlichen Geburtsfehler 16 zugeordnet. Expression von Nkx2.5 ist der früheste Marker für Herz-Vorläuferzellen in allen Wirbeltieren so weit untersucht und ist essentiell für die richtige Herz-Septierung und Bildung / Reifung der elektrischen Leitung System 16. Bei Wirbeltieren, den Beginn und das Muster der frühen Nkx2.5 Ausdruck etwa mit dem Timing und des kardialen Spezifikation in der frühen Embryogenese zusammenfallen, und Nkx2.5 Gens weiterhin durch die Entwicklung in der Herz 16 ausgedrückt werden. In unserem hESC Modell erschien NAM zur kardialen Induktion direkt aus pluripotenten hES durch die Förderung der Expression von Herz-spezifische transcri auslösenption Faktor Nkx2.5 in einem Prozess, der Spezifikation der cardiomesoderm aus der pluripotenten Epiblast in humanen embryonalen Kardiogenese könnte emulieren. Zukünftige Studien werden genetische und epigenetische Kontrolle Moleküle in menschlichen Herzens Entwicklung zeigen, als Alternativen, die den Weg für kleines Molekül-vermittelten direkten Kontrolle und Modulation der hESC pluripotent Schicksal bereiten bei der Ableitung von klinisch relevanten Linien für regenerative Therapien. Ohne NAM Behandlung wird &lt;2% hESCs spontane Differenzierung zu schlagen Kardiomyozyten 12-15 unterziehen. Mit NAM Behandlung haben wir in der Lage,&gt; 95% embryonale Herz-Vorstufen und&gt; 50% schlagen Kardiomyozyten aus hES unter define Kultur in einem Prozess, menschliche embryonale Herz Entwicklung 12 emulieren könnte aufrechterhalten zu generieren. Kürzlich haben die bekannten Herz-Schicksal bestimmen Gene verwendet worden, um Maus-Fibroblasten in der postnatalen schlagen Kardiomyozyten mit einem niedrigen Wirkungsgrad von &lt;0,5% 17, 18 transdifferenzieren &lt;/ Sup&gt;. Allerdings haben umprogrammiert Körperzellen historisch mit abnormen Genexpression und beschleunigte Seneszenz mit eingeschränkter therapeutischen Nutzen 19-21 in Verbindung gebracht. Schließlich ist das Protokoll, gründeten wir hier, um pluripotente hES aus der inneren Zellmasse (ICM) oder Epiblast des menschlichen Blastozyste 4,5 abgeleitet begrenzt, darf nicht auf andere pluripotente Zellen, einschließlich Tier-Ursprung WSR WSR aus früheren Morula abgeleitet sind (Acht-Zell)-Embryonen 22 und künstlich reprogrammierten Zellen 23.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Gelatine </td><td> Sigma </td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Bioscience </td><td> 356231 </td><td> Growth Faktor reduziert </td></tr><tr><td> Menschliche Laminin </td><td> Sigma </td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td> Nicotinamid </td><td> Sigma </td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565042 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM-KO </td><td> Invitrogen </td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td> Knock-out Serumersatz </td><td> Invitrogen </td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> MEM nicht essentielle Aminosäure-Lösung (MNAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> MEM Aminosäuren-Lösung (MEAA, 100X) </td&gt; <td> Invitrogen </td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td> Invitrogen </td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td> Askorbinsäure </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td> Menschliches Transferrin </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td> Menschliche bFGF </td><td> PeproTech </td><td> AF-100-18B </td><td></td></tr><tr><td> Human-Insulin </td><td> Invitrogen </td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td> Menschliche Activin A </td><td> PeproTech </td><td> 120-14E </td><td></td></tr><tr><td> Definierte FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30073-03 </td><td></td></tr><tr><td> 6-well ultraniedrigen Befestigungsplatte </td><td> Corning </td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6-Well-Platte </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

effiziente ableitung von human cardiac vorstufen und kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen stammzellen mit small molecule induction

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Bis heute hat das Fehlen eines geeigneten menschlichen Herzzellen Quelle der schweren Rückschlag bei der Regeneration des menschlichen Myokard wurden, entweder durch zellbasierte Transplantation oder durch kardiale Tissue Engineering 1-3. Kardiomyozyten werden bald nach der Geburt terminal differenzierten und verlieren ihre Fähigkeit sich zu vermehren. Es gibt keine Beweise dafür, dass Stammzellen / Vorläuferzellen aus anderen Quellen, wie zB dem Knochenmark oder Nabelschnurblut gewonnen werden können, steigen die kontraktilen Herzmuskelzellen geben nach der Transplantation in das Herz 1-3. Die Notwendigkeit, sich zu regenerieren oder zu reparieren die beschädigten Herzmuskel nicht von adulten Stammzellen-Therapie, entweder endogene oder via Zelle Lieferung 1-3 erfüllt. Die genetisch stabil humanen embryonalen Stammzellen (hES) haben unbegrenzte Expansion Fähigkeit und uneingeschränkten Formbarkeit, kredenzen eine pluripotente Reservoir für in vitro Ableitung von großen Lieferungen von menschlichen Körperzellen, die die Linie in Not eingeschränkt werdender Reparatur und Regeneration 4,5. Aufgrund der Prävalenz von Herz-Kreislauf-Erkrankungen weltweit und akuten Mangel an Spenderorganen, gibt es intensives Interesse an der Entwicklung von hES-basierte Therapien als ein alternativer Ansatz. Allerdings hat, wie die breite Differenzierungspotential von pluripotenten hES effizient und vorhersagbar Kanal zu einem gewünschten Phänotyp eine große Herausforderung sowohl für Entwicklungs-Studie und klinische Übersetzung worden. Herkömmliche Ansätze beruhen auf multi-lineage Neigung von pluripotenten Zellen durch spontane Keimblatt Differenzierung, was ineffizient und unkontrollierbare Linie-Engagement, das oft durch phänotypische Heterogenität und Instabilität, damit ein hohes Risiko für Tumorigenität 6-8 (siehe schematischer in gefolgt wird Abb.. 1A). Darüber hinaus können ausländische undefined / Tier biologische Zusatzstoffe und / oder Anleger, die typischerweise für die Isolierung, Expansion und Differenzierung von hES verwendet wurden um direkte Verwendung solcher Zell-Spezialisierungzed Transplantaten in Patienten problematisch 9-11. Um diese Hindernisse zu überwinden, haben wir die Elemente einer definierten Kultur-System notwendig und hinreichend für die Erhaltung der Pluripotenz von hES Epiblast gelöst und dient als Plattform für die de novo Ableitung von klinisch-geeignet hESCs und effektiv leiten wie hESCs gleichmäßig in Richtung klinisch relevanter Linien durch kleine Moleküle 12 (siehe schematische Abb.. 1B). Nach dem Screening einer Vielzahl von kleinen Molekülen und Wachstumsfaktoren, fanden wir, dass solche definierten Bedingungen Nicotinamid (NAM) ausreichen, um die Spezifikation von cardiomesoderm direkt aus pluripotenten hES, die weiter nach Kardioblasten, dass die menschliche schlagen Kardiomyozyten mit hohem Wirkungsgrad erzeugt fortgeschritten induzieren (Abb. 2 dargestellt ). Wir definierten Bedingungen für die Induktion von Kardioblasten direkt aus pluripotenten hES ohne Zwischenschaltung einer multi-lineage Embryoidkörper Bühne, so dass gut kontrollierte effiziente Ableitung einesgroßen Vorrat an menschlichen Herzzellen im gesamten Spektrum der Entwicklungsstadien für die Zell-basierter Therapeutika.

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Kardioblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen kardialen Vorläuferzellen und funktionelle Kardiomyozyten für Herz-Kreislauf-Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Bisher stellte das Fehlen einer geeigneten menschlichen Herzzellquelle das größte Hindernis bei der Regeneration des menschlichen Myokards dar, sei es durch zellbasierte ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Herzzellen direkt und ausschließlich aus pluripotenten menschlichen embryonalen Stammzellen mittels Induktion durch kleine Moleküle zu gewinnen. Dies wird erreicht, indem Nicotinamid zu undifferenzierten menschlichen ES-Zellen hinzugefügt wird, die unter definierten Bedingungen kultiviert werden. Anschließend werden die kardial differenzierenden Zellen abgelöst, um Kardioblasten zu bilden, die als schwimmende zelluläre Cluster in einer Suspensionkultur vorliegen.Nach ihrer Bildung werden Kardioblasten in ein kardiales Differenzierungsmedium überführt, in dem sie sich weiter zu schlagenden Kardiomyozyten entwickeln. Abschließend werden die Ergebnisse mittels Immunfluoreszenz in Kombination mit Dekonvolutions- oder konfokaler Mikroskopie sowie durch elektrophysiologische Ableitungen bewertet. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine effiziente Induktion pluripotenter humaner embryonaler Stammzellen ausschließlich in eine kardiale Linie durch einfache Zugabe von kleinen Molekülen ermöglicht.Während bei bestehenden Methoden der multilinieären Differenzierung nur ein kleiner Anteil der Zellen ein kardiales Phänotyp verfolgt. Es gibt einige Schritte, auf die man achten sollte, wenn man Stammlösungen herstellt. Achten Sie darauf, Matrigel und humanes Laminin langsam über Nacht von minus 80 Grad Celsius auf vier Grad Celsius aufzutauen, lagern Sie das Medium bei vier Grad Celsius und erwärmen Sie das Medium stets vor der Anwendung auf 37 Grad Celsius.Außerdem werden bei der Zubereitung des humanen ES-Zell-Mediums einige Zusatzstoffe erst unmittelbar vor der Verwendung hinzugefügt. Dazu gehören BFGF, Ascorbinsäure, humanes Insulin aktiv in A und Transferin. Danach stellen Sie die Arbeitslösungen von Matrigel oder humanem Laminin unmittelbar vor der Beschichtung der Platten her.Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad SIU in 5 % Kohlendioxid, nachdem die mit Gelatine vorbeschichteten Zellkulturplatten vorbereitet wurden. Die Gelatine kann durch die Matra-Gel- oder Laminin-Arbeitslösung ersetzt werden. Beschichten Sie diese Platten, indem Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.Beginnen Sie damit, menschliche ES-Zellkolonien fünf bis sieben Tage wachsen zu lassen, und bereiten Sie dann einige von ihnen zum Teilen vor. Wählen Sie Kolonien mit mehr als 75 % undifferenzierten menschlichen ES-Zellen aus. Diese sind in der Regel leicht trüb mit scharf abgegrenzten Rändern und enthalten aufgehäufte Zellen. Ein Hinweis auf den Beginn der Differenzierung ist oft eine weiße Färbung; Kolonien, die hauptsächlich aus differenzierten Zellen bestehen, erscheinen dagegen meist klar.Wählen Sie keine weißen oder durchsichtigen Kolonien aus. Halten Sie die Platten gegen das Licht und umranden Sie mit einem Stift die leicht opaken Kolonien an der Unterseite der Platten entlang der Konturen. Verwenden Sie die Kante einer sterilen P2-Pipettenspitze, um die umgebende Fibroblastenschicht von der humanen ES-Zellkolonie zu lösen.Entfernen Sie dann die umgebenden Fibroblastenzellen sowie alle differenzierten Anteile der Kolonie. Saugen Sie anschließend das alte Medium, das die abgelösten differenzierten Zellen enthält, ab. Waschen Sie danach die undifferenzierten Zellen in jedem Well einmal mit menschlichem ES-Zell-Medium ohne BFGF und geben Sie anschließend drei Milliliter frisches menschliches ES-Zell-Medium mit B-F-G-F-B-F-G-F hinzu, das unmittelbar vor der Verwendung dem frischen Medium zugesetzt wird.Verwenden Sie nun eine sterile P2-Pipettenspitze, um die Kolonien in kleine Stücke zu schneiden und sie von der Platte zu lösen. Ziehen Sie die gelösten Koloniestücke zusammen mit ihrem Medium in ein 50-Milliliter-Konischglas. Ziehen Sie zusätzlich ein Milliliter Medium zur Nachspülung pro Vertiefung auf.Die Zellen sind nun bereit für eine weitere Differenzierung unter Verwendung von kleinen Molekülen. Erwärmen Sie frisch beschichtete Platten zunächst auf 37 Grad Celsius. Aspirieren Sie die Beschichtungslösung von den Platten und geben Sie ein vier Milliliter aliquotiertes Medium mit Koloniestücken in jedes Well. Überführen Sie die Platten anschließend vorsichtig, ohne sie zu schütteln, in einen Inkubator.Die Platten nicht stören, damit sie sich anheften können. Anschließend den größten Teil des alten Mediums entfernen, wobei gerade genug Medium zurückbleibt, sodass die Zellen weiterhin untergetaucht bleiben. Die Zellen dürfen niemals austrocknen.Mischen Sie frisches menschliches ESL-Medium, das basisches FGF und Nicotinamid enthält, und geben Sie die angegebene Anzahl Milliliter dieses Mediums in jede Vertiefung. Das Medium kann bis zu zwei Wochen bei vier Grad Celsius gelagert werden, wobei es alle zwei Tage verwendet werden kann, um die Zellkultur zu erneuern und die Kolonien wachsen zu lassen. Nach acht bis zehn Tagen haben die Zellen morphologische Veränderungen durchlaufen und sich zu großen, differenzierten Zellen vergrößert, die sich vermehrt und übereinander angesammelt haben.Danach mit einer Suspensionkultur fortfahren, um eine Suspensionkultur zu erstellen: Beginnen Sie damit, ESL-Kolonien von spontan differenzierten Zellen abzulösen, die ausgewandert sind und eine Fibroblastenschicht gebildet haben. Verwenden Sie dazu die oben genannte Technik mit einer sterilen Pipettenspitze und aspirieren Sie anschließend das alte Medium, das abgelöste schwimmende Fibroblastenzellen enthält. Waschen Sie die Zellen einmal mit HESC-Medium und resuspendieren Sie sie in drei Milliliter HESC-Medium unter Verwendung einer sterilen P2-Pipettenspitze.Schneiden Sie die Kolonien in kleine Stücke und lösen Sie sie von der Platte ab. Ziehen Sie das Medium mit den abgelösten Kolonien in ein einzelnes kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie die Mulden mit einem Milliliter Medium aus und geben Sie die Abspülung zum Sammelgefäß hinzu.Anschließend aliquotieren Sie vier Milliliter der gepoolten Zellen in jede Vertiefung einer sechswelligen Ultra-Low-Attachment-Platte für vier bis fünf Tage. Stellen Sie die Platte in einen Inkubator, um die Bildung schwimmender zellulärer Cluster oder Kardioblasten zu ermöglichen, um die Kardioblasten zum schlagenden Kardiomyozyten-Phänotyp weiterzuentwickeln. Sammeln Sie sie zusammen mit ihrem Medium in einem 50-Milliliter-Konischgefäß.Anschließend die Zellen fünf Minuten lang bei 1.400 U/min zentrifugieren. Das Überstandmedium absaugen, so viel wie möglich vom alten Medium wiegen und eine gleiche Menge frisches Differenzierungsmedium für Herzzellen hinzufügen. Medium, das 10 Millimolar Nicotinamid enthält.Mischen Sie die schwimmenden Kardioblasten durch Pipettieren und portionieren Sie jeweils vier Milliliter der Kardioblastensuspension in jede Vertiefung einer 6-Loch-Gewebekulturplatte. Überführen Sie die Platten in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius, um den Kardioblasten über Nacht die Anheftung an die Gewebekulturplatten zu ermöglichen. Wechseln Sie alle zwei Tage das Kulturmedium.Ersetzen Sie das kardiale Differenzierungsmedium, das am achten Tag 10 min molin Nikotinamid enth&auml;lt. Wechseln Sie zum kardialen Differenzierungsmedium ohne Nikotinamid und ersetzen Sie das Medium weiterhin jeden zweiten Tag.Binnen zwei Wochen nach dem Entzug von Nicotinamid beginnen schlagende Kardiomyozyten aufzutreten und nehmen an Zahl zu. Nicotinamid ist ausreichend, um humane ES-Zellen, die in einem definierten Kultursystem gehalten werden, vom pluripotenten Zustand ausschließlich in ein kardiales Mesoderm-Phänotyp zu überführen. Nach der Exposition undifferenzierter humaner ES-Zellen gegenüber Nicotinamid gingen alle Zellen der Kolonie morphologische Veränderungen ein und wurden zu großen differenzierten Zellen, die die Expression von OCT4 herunterregulierten. Die Zellen begannen zudem, den kardialspezifischen Transkriptionsfaktor NKX2.5 sowie Alpha-Aktinin zu exprimieren.Beide Merkmale stimmen mit dem Kardio-Mesoderm-Phänotyp überein. Diese differenzierten Zellen teilen sich weiterhin und nehmen in Grö&szlig;e zu in Bereichen der Kolonien, in denen sich Zellen angeh&auml;uft hatten. Die Expression von NKX 2.5 wurde intensiver. Nach der Abl&ouml;sung bildeten die mit Nicotinamid behandelten humanen ES-Zellen Kardioblasten in einer Suspensionkultur.Nachdem die Kardioblasten anheften durften, wurden sie eine Woche lang mit Nicotinamid behandelt. Ein bis zwei Wochen nach dem Entzug von Nicotinamid begannen schlagende Kardiomyozyten mit einer drastischen Steigerung der Effizienz zu erscheinen. Diese zeigten sich als zelluläre Aggregate, die mit rhythmischen Kontraktionen pulsierten. Spontane multiliniale Differenzierung von Zellen, die keiner IDE-Behandlung unterzogen wurden, wies diese Merkmale nicht auf. Zellen innerhalb der pulsierenden Kardiomyozyten-Cluster exprimierten Marker, die für Kardiomyozyten charakteristisch sind, einschließlich NK X 2.5 und Alpha-Aktinin.Die Kontraktionen der schlagenden Kardiomyozyten wurden durch elektrische Profile bestätigt, die stark, rhythmisch und koordiniert sowie gut synchronisiert waren; sie zeigten regelmäßige Impulse, die an die P-Q-R-S-T-Komplexe erinnerten, wie sie bei klinischen Elektrokardiogrammen an Körperoberflächenelektroden beobachtet werden. Darüber hinaus konnten die Kardiomyozyten ihre starke Kontraktilität mehr als drei Monate lang beibehalten, sobald die Technik beherrscht war. Diese Technik kann verwendet werden, um innerhalb von etwa fünf Wochen aus pluripotenten menschlichen embryonalen Stammzellen einheitlich Herzzellvorläufer und schlagende Kardiomyozyten zu erzeugen, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Neuroblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen neuronalen Vorläuferzellen und neuronalen Zelltypen in sich entwickelnden ZNS für neuronale Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

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Erfahren Sie die effiziente Ableitung von Kardiomyozyten aus humanen embryonalen Stammzellen mittels Small-Molecule-Induktion mit Nicotinamid. Diese Methode ermöglicht die gezielte Generierung funktioneller Herzzellen für kardiovaskuläre Forschung.

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction (Video) | JoVE Journal

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

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