Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Herzzellen direkt und ausschließlich aus pluripotenten menschlichen embryonalen Stammzellen mittels Induktion durch kleine Moleküle zu gewinnen. Dies wird erreicht, indem Nicotinamid zu undifferenzierten menschlichen ES-Zellen hinzugefügt wird, die unter definierten Bedingungen kultiviert werden. Anschließend werden die kardial differenzierenden Zellen abgelöst, um Kardioblasten zu bilden, die als schwimmende zelluläre Cluster in einer Suspensionkultur vorliegen.

Nach ihrer Bildung werden Kardioblasten in ein kardiales Differenzierungsmedium überführt, in dem sie sich weiter zu schlagenden Kardiomyozyten entwickeln. Abschließend werden die Ergebnisse mittels Immunfluoreszenz in Kombination mit Dekonvolutions- oder konfokaler Mikroskopie sowie durch elektrophysiologische Ableitungen bewertet. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine effiziente Induktion pluripotenter humaner embryonaler Stammzellen ausschließlich in eine kardiale Linie durch einfache Zugabe von kleinen Molekülen ermöglicht.

Während bei bestehenden Methoden der multilinieären Differenzierung nur ein kleiner Anteil der Zellen ein kardiales Phänotyp verfolgt. Es gibt einige Schritte, auf die man achten sollte, wenn man Stammlösungen herstellt. Achten Sie darauf, Matrigel und humanes Laminin langsam über Nacht von minus 80 Grad Celsius auf vier Grad Celsius aufzutauen, lagern Sie das Medium bei vier Grad Celsius und erwärmen Sie das Medium stets vor der Anwendung auf 37 Grad Celsius.

Außerdem werden bei der Zubereitung des humanen ES-Zell-Mediums einige Zusatzstoffe erst unmittelbar vor der Verwendung hinzugefügt. Dazu gehören BFGF, Ascorbinsäure, humanes Insulin aktiv in A und Transferin. Danach stellen Sie die Arbeitslösungen von Matrigel oder humanem Laminin unmittelbar vor der Beschichtung der Platten her.

Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad SIU in 5 % Kohlendioxid, nachdem die mit Gelatine vorbeschichteten Zellkulturplatten vorbereitet wurden. Die Gelatine kann durch die Matra-Gel- oder Laminin-Arbeitslösung ersetzt werden. Beschichten Sie diese Platten, indem Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.

Beginnen Sie damit, menschliche ES-Zellkolonien fünf bis sieben Tage wachsen zu lassen, und bereiten Sie dann einige von ihnen zum Teilen vor. Wählen Sie Kolonien mit mehr als 75 % undifferenzierten menschlichen ES-Zellen aus. Diese sind in der Regel leicht trüb mit scharf abgegrenzten Rändern und enthalten aufgehäufte Zellen. Ein Hinweis auf den Beginn der Differenzierung ist oft eine weiße Färbung; Kolonien, die hauptsächlich aus differenzierten Zellen bestehen, erscheinen dagegen meist klar.

Wählen Sie keine weißen oder durchsichtigen Kolonien aus. Halten Sie die Platten gegen das Licht und umranden Sie mit einem Stift die leicht opaken Kolonien an der Unterseite der Platten entlang der Konturen. Verwenden Sie die Kante einer sterilen P2-Pipettenspitze, um die umgebende Fibroblastenschicht von der humanen ES-Zellkolonie zu lösen.

Entfernen Sie dann die umgebenden Fibroblastenzellen sowie alle differenzierten Anteile der Kolonie. Saugen Sie anschließend das alte Medium, das die abgelösten differenzierten Zellen enthält, ab. Waschen Sie danach die undifferenzierten Zellen in jedem Well einmal mit menschlichem ES-Zell-Medium ohne BFGF und geben Sie anschließend drei Milliliter frisches menschliches ES-Zell-Medium mit B-F-G-F-B-F-G-F hinzu, das unmittelbar vor der Verwendung dem frischen Medium zugesetzt wird.

Verwenden Sie nun eine sterile P2-Pipettenspitze, um die Kolonien in kleine Stücke zu schneiden und sie von der Platte zu lösen. Ziehen Sie die gelösten Koloniestücke zusammen mit ihrem Medium in ein 50-Milliliter-Konischglas. Ziehen Sie zusätzlich ein Milliliter Medium zur Nachspülung pro Vertiefung auf.

Die Zellen sind nun bereit für eine weitere Differenzierung unter Verwendung von kleinen Molekülen. Erwärmen Sie frisch beschichtete Platten zunächst auf 37 Grad Celsius. Aspirieren Sie die Beschichtungslösung von den Platten und geben Sie ein vier Milliliter aliquotiertes Medium mit Koloniestücken in jedes Well. Überführen Sie die Platten anschließend vorsichtig, ohne sie zu schütteln, in einen Inkubator.

Die Platten nicht stören, damit sie sich anheften können. Anschließend den größten Teil des alten Mediums entfernen, wobei gerade genug Medium zurückbleibt, sodass die Zellen weiterhin untergetaucht bleiben. Die Zellen dürfen niemals austrocknen.

Mischen Sie frisches menschliches ESL-Medium, das basisches FGF und Nicotinamid enthält, und geben Sie die angegebene Anzahl Milliliter dieses Mediums in jede Vertiefung. Das Medium kann bis zu zwei Wochen bei vier Grad Celsius gelagert werden, wobei es alle zwei Tage verwendet werden kann, um die Zellkultur zu erneuern und die Kolonien wachsen zu lassen. Nach acht bis zehn Tagen haben die Zellen morphologische Veränderungen durchlaufen und sich zu großen, differenzierten Zellen vergrößert, die sich vermehrt und übereinander angesammelt haben.

Danach mit einer Suspensionkultur fortfahren, um eine Suspensionkultur zu erstellen: Beginnen Sie damit, ESL-Kolonien von spontan differenzierten Zellen abzulösen, die ausgewandert sind und eine Fibroblastenschicht gebildet haben. Verwenden Sie dazu die oben genannte Technik mit einer sterilen Pipettenspitze und aspirieren Sie anschließend das alte Medium, das abgelöste schwimmende Fibroblastenzellen enthält. Waschen Sie die Zellen einmal mit HESC-Medium und resuspendieren Sie sie in drei Milliliter HESC-Medium unter Verwendung einer sterilen P2-Pipettenspitze.

Schneiden Sie die Kolonien in kleine Stücke und lösen Sie sie von der Platte ab. Ziehen Sie das Medium mit den abgelösten Kolonien in ein einzelnes kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie die Mulden mit einem Milliliter Medium aus und geben Sie die Abspülung zum Sammelgefäß hinzu.

Anschließend aliquotieren Sie vier Milliliter der gepoolten Zellen in jede Vertiefung einer sechswelligen Ultra-Low-Attachment-Platte für vier bis fünf Tage. Stellen Sie die Platte in einen Inkubator, um die Bildung schwimmender zellulärer Cluster oder Kardioblasten zu ermöglichen, um die Kardioblasten zum schlagenden Kardiomyozyten-Phänotyp weiterzuentwickeln. Sammeln Sie sie zusammen mit ihrem Medium in einem 50-Milliliter-Konischgefäß.

Anschließend die Zellen fünf Minuten lang bei 1.400 U/min zentrifugieren. Das Überstandmedium absaugen, so viel wie möglich vom alten Medium wiegen und eine gleiche Menge frisches Differenzierungsmedium für Herzzellen hinzufügen. Medium, das 10 Millimolar Nicotinamid enthält.

Mischen Sie die schwimmenden Kardioblasten durch Pipettieren und portionieren Sie jeweils vier Milliliter der Kardioblastensuspension in jede Vertiefung einer 6-Loch-Gewebekulturplatte. Überführen Sie die Platten in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius, um den Kardioblasten über Nacht die Anheftung an die Gewebekulturplatten zu ermöglichen. Wechseln Sie alle zwei Tage das Kulturmedium.

Ersetzen Sie das kardiale Differenzierungsmedium, das am achten Tag 10 min molin Nikotinamid enthält. Wechseln Sie zum kardialen Differenzierungsmedium ohne Nikotinamid und ersetzen Sie das Medium weiterhin jeden zweiten Tag.

Binnen zwei Wochen nach dem Entzug von Nicotinamid beginnen schlagende Kardiomyozyten aufzutreten und nehmen an Zahl zu. Nicotinamid ist ausreichend, um humane ES-Zellen, die in einem definierten Kultursystem gehalten werden, vom pluripotenten Zustand ausschließlich in ein kardiales Mesoderm-Phänotyp zu überführen. Nach der Exposition undifferenzierter humaner ES-Zellen gegenüber Nicotinamid gingen alle Zellen der Kolonie morphologische Veränderungen ein und wurden zu großen differenzierten Zellen, die die Expression von OCT4 herunterregulierten. Die Zellen begannen zudem, den kardialspezifischen Transkriptionsfaktor NKX2.5 sowie Alpha-Aktinin zu exprimieren.

Beide Merkmale stimmen mit dem Kardio-Mesoderm-Phänotyp überein. Diese differenzierten Zellen teilen sich weiterhin und nehmen in Größe zu in Bereichen der Kolonien, in denen sich Zellen angehäuft hatten. Die Expression von NKX 2.5 wurde intensiver. Nach der Ablösung bildeten die mit Nicotinamid behandelten humanen ES-Zellen Kardioblasten in einer Suspensionkultur.

Nachdem die Kardioblasten anheften durften, wurden sie eine Woche lang mit Nicotinamid behandelt. Ein bis zwei Wochen nach dem Entzug von Nicotinamid begannen schlagende Kardiomyozyten mit einer drastischen Steigerung der Effizienz zu erscheinen. Diese zeigten sich als zelluläre Aggregate, die mit rhythmischen Kontraktionen pulsierten. Spontane multiliniale Differenzierung von Zellen, die keiner IDE-Behandlung unterzogen wurden, wies diese Merkmale nicht auf. Zellen innerhalb der pulsierenden Kardiomyozyten-Cluster exprimierten Marker, die für Kardiomyozyten charakteristisch sind, einschließlich NK X 2.5 und Alpha-Aktinin.

Die Kontraktionen der schlagenden Kardiomyozyten wurden durch elektrische Profile bestätigt, die stark, rhythmisch und koordiniert sowie gut synchronisiert waren; sie zeigten regelmäßige Impulse, die an die P-Q-R-S-T-Komplexe erinnerten, wie sie bei klinischen Elektrokardiogrammen an Körperoberflächenelektroden beobachtet werden. Darüber hinaus konnten die Kardiomyozyten ihre starke Kontraktilität mehr als drei Monate lang beibehalten, sobald die Technik beherrscht war. Diese Technik kann verwendet werden, um innerhalb von etwa fünf Wochen aus pluripotenten menschlichen embryonalen Stammzellen einheitlich Herzzellvorläufer und schlagende Kardiomyozyten zu erzeugen, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.