Name: GENPLAT: eine automatisierte Plattform für Biomasse Enzym-Entdeckung und Cocktail-Optimierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Erfahren Sie, wie GENPLAT Enzym-Cocktails für die Biomasseabbau-Optimierung automatisiert. Diese Plattform steigert die Effizienz bei der Umwandlung von Lignozellulose in fermentierbare Zucker für die Biofuelproduktion.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch das US Department of Energy Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE Office of Science BER DE-FC02-07ER64494) und gewähren DE-FG02-91ER200021 aus dem US Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences, Division finanziert of Chemical Sciences, Geosciences and Biosciences. Wir bedanken uns bei John Scott-Craig und Melissa Borrusch für ihre materielle und konzeptionelle Beiträge.

1. Enzymproduktion <ol><li> Produzieren Proteine ​​in Pichia pastoris durch Klonierung der entsprechenden Gene in Vektoren pPICZ oder pPICZα und die Umwandlung in P. pastoris. Wachsen Zellen in 300-ml Ansätzen in verblüffte 500-ml-Kolben mit Methanol Induktion alle 24 h (Banerjee et al., 2010a). </li><li> Konzentrieren Sie sich und entsalzen die Kultur Filtrate durch Tangentialflussfiltration. </li><li> Bewahren Sie die Enzyme in kleinen Portionen in 20% Glycerin bei -80 ° C. Der Konzentrationsbereich ist 1-10 mg / ml. </li></ol> 2. Design of Experiment <ol><li> Geben Sie die Anzahl der Enzyme getestet werden, deren obere und untere Proportionen (zB einen geringeren Anteil von 5% für Kern-Enzyme), und die Art des experimentellen Designs (zB quadratisch oder kubisch) in die Design-Expertsoftware. </li><li> Berechnen Sie die Menge in ug jedes Enzym hinzugefügt, um eine Gesamtbelastung von 15 mg / g Glucan zu machen, und dann berechnen die Höhe des jeweiligen Enzyms in ul zu ergänzenjede Reaktion. </li><li> Generate Excel-Arbeitsblätter Angabe Quelle Laborgeräte, Quelle Brunnen, Ziel-geräte, Ziel Brunnen und Transfervolumen für die Abgabe von Wasser und Enzymen nach dem experimentellen Design und importieren Sie es in der Biomek FXP Software mit dem Transfer-from-Datei-Funktion. </li></ol> 3. Enzymatische Hydrolyse <ol><li> Suspend der Biomasse Gülle in 50 mM Natriumcitrat, pH 4,8, enthält 5 pg / ml Tetracyclin und 5 pg / ml Cycloheximid, in dem Paddel Reservoir. </li><li> Robotically pipet 200 ul der Gülle in jede Vertiefung einer 96-Well-Deep-Well-Platten mit Reaktion Span-8-1000-ul Pipettenspitzen mit den letzten 0,5 cm abgeschnitten. Mix der Schlamm einmal bei 100 ul / sec und dann absaugen das gleiche Volumen aus dem Paddel Reservoir und verzichten in den Platten. </li><li> Dispense die Enzyme in die gleiche Platte mit dem Programm in den Beckman FX eingetragen. </li><li> Seal die Platten mit durchstechbarer CapMats. </li><li> Invert und tippen Sie aufdie Platten mehrfach zu überwinden Oberflächenspannung. Legen Sie die Platten bei 50 ° C für 48 Stunden in der Hybridisierung Inkubator rotierenden bei 10 Umdrehungen pro Minute. </li></ol> 4. Bestimmung von Glc und Xyl <ol><li> Centrifuge die Reaktion Platten für 3 min bei 1250 xg in einem Ausschwingrotor zentrifugiert. </li><li> Transfer 100 ul des Überstands in reguläre 96-Well-Platten mit dem AP96 pod des Biomek FX. </li><li> Die Inkubation bei 90-95 ° C für 10 min, um die Enzyme zu inaktivieren, und dann Zentrifuge bei 1250 xg für 30 sec. </li><li> Für Glc Messungen, Transfer 12 ul der Überstände in regelmäßigen 96-Well-Platten. Addieren Sie 192 hinzu ul der Glucose-Oxidase / Peroxidase (GOPOD) Reagenz. Die Inkubation bei 50 ° C für 20 min und die Absorbanz bei 510 nm in einem Mikroplatten-Reader. Blank ist Reaktionsgemisch ohne Enzym. </li><li> Für Xyl Messungen, Transfer 4 ul in 384-Well-Platten. Fügen Sie den Reagenzien des Assays und lesen Sie die Platten bei 340 nm. Leerwird das Reaktionsgemisch ohne Enzym. </li></ol> 5. Data Analysis <ol><li> Konvertieren Sie die Extinktionswerte auf ihre% Glc und Xyl Renditen auf den bekannten Glc und Xyl Inhalt der ursprünglichen Biomasse. Importieren Sie diese Prozentsätze wie die Reaktionen in den Design-Expert-Software. Überprüfen Sie die statistischen Parameter umfassen, um sicherzustellen, dass die Kriterien für eine robuste Modell erfüllt sind. </li><li> Bestätigen Sie das beste Modell Vorhersage experimentell. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse mit GENPLAT: (1) Erstellung von optimierten Mischungen der einzelnen reine Proteine. Die Ergebnisse zeigen, welche Enzyme wichtig sind, und in welchem ​​Verhältnis, und auch die Enzyme sind nicht wichtig. Einige Proteine, die reichlich vorhanden sind in der T. reesei Sekretom (Nagendran et al., 2009), wie Cip1 und Cip2, scheinen keine Rolle in Glc Lüftspiel aus Maisstroh vorbehandelt durch Ammoniak-Faser-Erweiterung (AFEX) oder alkalische hyd rogen Peroxid (AHP) (Banerjee et al., 2010b). Auf der anderen Seite sind einige Proteine ​​unerwartet wichtig. Zum Beispiel sind Endo-Xylanasen von Glykosylhydrolase Familien 10 und 11 sowohl für Glc Freisetzung wichtig, eine Xylanase kann nicht für die anderen (. Banerjee et al, 2010b, c) zu ersetzen. Cel61A, eine kleine Protein in der T. reesei Sekretom, ist sehr wichtig für Glc aber nicht Xyl freizugeben. Einige Enzyme sind für die Freilassung der beiden Glc und Xyl wichtig, wohingegen andere nur für den einen oder anderen (Banerjee et al., 2010c) sind notwendig. Ein synthetisches Gemisch mit 16 Komponenten, die jeweils in einer Konzentration von 0,94 mg / ml (dh eine nicht-optimierte Mischung), veröffentlicht 38% der verfügbaren Glc von AFEX-vorbehandelte DDG. Unter identischen Bedingungen Hydrolyse, eine optimierte Mischung, in denen die Konzentrationen der 16 Komponenten im Bereich von 0% bis 32%, veröffentlicht 52% der Glc (Abb. 2). Dieses Experiment zeigt den Nutzen der Konstruktion definierte Mischungen. _content "&gt; (2) Schaffung von optimierten Cocktails für unterschiedliche Vorbehandlung / Substrat-Kombinationen. Current kommerziellen Cellulase Präparate sind" one-size-fits-all ". In Wirklichkeit hängt die besten Cocktail-sowohl auf dem Substrat und der Vorbehandlung. Ein einzelnes Produkt wie Accellerase 1000 gibt unterschiedliche Erträge aus verschiedenen Substraten auf die gleiche Weise vorbehandelt, und aus dem gleichen Substrat ausgesetzt unterschiedlichen Vorbehandlungen (Abb. 1). Wir haben GENPLAT verwendet werden, um Mischungen von reinen Enzymen für mehrere Vorbehandlungen und Vielfaches Rohstoffe (Banerjee et optimieren al., 2010c). Abbildung 2 zeigt, wie die optimale Enzym Proportionen von 16 reine Enzyme für AFEX-vorbehandelte Maisstroh, AHP-vorbehandelten Maisstroh und AFEX-vorbehandelte DDG unterscheidet. Nur 11 Enzyme sind in Abb. gezeigt. 2, da die optimale Anteile der übrigen fünf (Cel61B, AbfB, Cip1, Cip2 und Cel12A) wurde festgestellt, dass 0% (Banerjee et al., 2010c). (3) Novel Enzym entdeckt T. gemacht reesei und A. niger auf unterschiedlichen Substraten gewachsen. Ein besonderes Extrakt steigerte Glc Ausbeute bei unseren Kern hinzugefügt. Die verantwortliche Protein wurde gereinigt und gezeigt, dass ein Roman Glykosylhydrolase nicht in jeder kommerziellen Enzympräparat (Banerjee und Walton, unveröffentlichte Ergebnisse) werden. (4) Entdeckung der besseren Enzyme. Nachdem mit GENPLAT die Enzyme sind die wichtigsten für den Abbau eines gezeigtinsbesondere Biomasse, haben wir ein besseres Verständnis für die Enzyme der Schwerpunkt für die Verbesserung sein sollte. Bessere Beispiele der kritischen Enzyme könnten durch die Suche in der Natur gefunden werden oder gemacht durch Protein-Engineering. (Ein Enzym könnte "besser" als ihre T. reesei homolog in mehrfacher Hinsicht abhängig von der gewünschten Eigenschaft, sank z. B. höhere spezifische Aktivität, größere Synergie, proteolytische Empfindlichkeit oder eine höhere thermische Stabilität). GENPLAT bietet eine sinnvolle Plattform für die Bestimmung von potentiell bessere Enzyme, weil es eine realistische komplexe Cocktail (wichtig, weil keine Biomasse Enzym arbeitet in Isolation) und eine realistische Substrat (wichtig nutzt, da die Ergebnisse mit reiner Cellulose oder anderen künstlichen Substraten möglicherweise nicht relevant für natürliche Lignozellulose Materialien). (5) Gewerbliche Enzym-Optimierung. Ausreichend große Mengen reiner Enzyme noch nicht in der realen Welt existieren. Bis sie es tun, Ethanol proProduzenten müssen auf kommerzielle Produkte wie Accellerase 1000 und MultifectXylanase verlassen. Allerdings Mischungen von handelsüblichen Enzymen in der Regel besser als jeder einzelne ein, und GENPLAT kann zur optimierten Cocktails von mehreren kommerziellen Enzyme Design. Abbildung 3 zeigt die Verwendung von GENPLAT um eine Mischung von vier kommerziellen Enzympräparate optimieren. Die optimale Proportionen für die Freigabe von Glc von AFEX-vorbehandelte DDG wurde festgestellt, dass 47% Accellerase1000, 27% Multifect Pektinase, 22% Novozyme 188 und 4% Multifect Xylanase (Banerjee et al., 2010c) werden. 3B zeigt die Unterschiede in Glc Ausbeute von AFEX-DDG mit vier Enzympräparate, die optimierte kommerzielle Mischung führt zu einer höheren Rendite als Glc Accellerase1000 allein SpezymeCP allein, oder ein 16-Komponente synthetischen Mischung. Dieses Experiment zeigt auch, dass die 16-Komponente synthetischen Mischung fehlt ein oder mehrere Enzyme für eine optimale Glc Release, das in einem oder mehreren der kommerziellen Enzyme benötigt werden. GENPLAT können unsed zu identifizieren solcher Komponenten. <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Keine einzige kommerzielle Enzympräparation ist optimal für alle Untergründe und alle Vorbehandlungen. Fünf Substrate und drei Vorbehandlungen wurden unter ähnlichen Bedingungen von Schleifen (0,5 mm Korngröße) verglichen, Enzymbeladung (15 mg / g Glucan) und Hydrolysebedingungen (48 h, 50 ° C). A. Verdauung verschiedener AFEX-vorbehandelte Substrate mit Accellerase 1000. B. Verdauung von Maisstroh vorbehandelt durch drei verschiedene Methoden mit Accellerase 1000 (siehe Banerjee et al., 2010c). <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Optimale Proportionen von 11 Enzymen für die Freisetzung von Glc von AFEX-vorbehandelte Maisstroh (AFEX-CS), alkalische Wasserstoffperoxid-vorbehandelte Maisstroh (AHP-CS) oder AFEX-vorbehandelte getrocknete destillierenERS "Körner (AFEX-DDG). Die Daten stammen aus Banerjee et al. (2010c). Die Zahlen entlang der Oberseite der Balken sind die Glc Erträge als prozentualer Anteil der gesamten Glc in der Biomasse Probe. <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. A. Die Verwendung von GENPLAT eine optimierte Mischung von vier kommerziellen Enzympräparate für die Freigabe von Glc von AFEX-vorbehandelte DDG zu produzieren. Multifect Xylanase aus den kleinsten Beitrag (4%) und wurde daher von dieser ternären Diagramm weggelassen. B. Glc Erträge aus AFEX-DDG mit verschiedenen Enzym-Behandlungen unter identischen Bedingungen Hydrolyse (15 mg / g Glucan Enzym, 48 h, 50 ° C) . "Vier-Komponenten-commercial" hat die Proportionen aus dem Experiment in Abb. bestimmt. 3A.

<ol><li>Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+MJ+%22DOE+Simplified%3A+Practical+Tools+for+Effective+Experimentation%22">DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation</a>. , 2nd Edition, Productivity Press. New York. (2007).</li>
<li>Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Aslam, N., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+enzyme+mixtures+for+biomass+deconstruction%3A+production+and+optimization+of+a+core+set%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioengineer%22%5BJournal%5D)">Synthetic enzyme mixtures for biomass deconstruction: production and optimization of a core set.</a> Biotechnol. Bioengineer. 106, 707-720 (2010).</li>
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<li>Berlin, A., Maximenko, V., Gilkes, N., Saddler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+enzyme+complexes+for+lignocellulose+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Optimization of enzyme complexes for lignocellulose hydrolysis.</a> Biotechnol. Bioeng. 97, 287-296 (2007).</li>
<li>Decker, S. R., Brunecky, R., Tucker, M. P., Himmel, M. E., Selig, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening+techniques+for+biomass+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Bioenerg.+Res%22%5BJournal%5D)">High throughput screening techniques for biomass conversion.</a> Bioenerg. Res. 2, 179-192 (2009).</li>
<li>Gao, D., Chundawat, S. P., Krishnan, C., Balan, V., Dale, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixture+optimization+of+six+core+glycosyl+hydrolases+for+maximizing+saccharification+of+ammonia+fiber+expansion+%28AFEX%29+pretreated+corn+stover%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">Mixture optimization of six core glycosyl hydrolases for maximizing saccharification of ammonia fiber expansion (AFEX) pretreated corn stover.</a> Bioresour. Technol. 101, 2770-2781 (2010).</li>
<li>Harris, P. V., Welner, D., McFarland, K. C., Re, E., Poulsen, J. C. N., Brown, K., Salbo, R., Ding, H., Vlasenko, E., Merino, S., Xu, F., Cherry, J., Larsen, S. Y., LoLeggio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+lignocellulosic+biomass+hydrolysis+by+proteins+of+glycoside+hydrolase+family+61%3A+Structure+and+function+of+a+large%2C+enigmatic+family%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stimulation of lignocellulosic biomass hydrolysis by proteins of glycoside hydrolase family 61: Structure and function of a large, enigmatic family.</a> Biochemistry. 49, 3305-3316 (2010).</li>
<li>Kim, E., Irwin, D. C., Walker, L. P., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factorial+optimization+of+a+six-cellulase+mixture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Factorial optimization of a six-cellulase mixture.</a> Biotechnol. Bioeng. 58, 494-501 (1998).</li>
<li>King, B. C., Donnelly, M. K., Bergstrom, G. C., Walker, L. P., Gibson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+microplate+assay+system+for+quantitative+evaluation+of+plant+cell+wall-degrading+enzyme+activity+of+fungal+culture+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">An optimized microplate assay system for quantitative evaluation of plant cell wall-degrading enzyme activity of fungal culture extracts.</a> Biotechnol. Bioeng. 102, 1033-1044 (2009).</li>
<li>Nagendran, S., Hallen-Adams, H. E., Paper, J. M., Aslam, N., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+genomic+potential+for+secreted+plant+cell-wall-degrading+enzymes+in+the+ectomycorrhizal+fungus+Amanita+bisporigera%2C+based+on+the+secretome+of+Trichoderma+reesei%5BTitle%5D)+AND+%22Fung.+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reduced genomic potential for secreted plant cell-wall-degrading enzymes in the ectomycorrhizal fungus Amanita bisporigera, based on the secretome of Trichoderma reesei.</a> Fung. Genet. Biol. 46, 427-435 (2009).</li>
<li>Rosgaard, L., Pedersen, S., Langston, J., Akerhielm, D., Cherry, J. R., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+minimal+Trichoderma+reesei+cellulase+mixtures+on+differently+pretreated+barley+straw+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Evaluation of minimal Trichoderma reesei cellulase mixtures on differently pretreated barley straw substrates.</a> Biotechnol. Prog. 23, 1270-1276 (2007).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Es ist allgemein anerkannt, dass die Senkung der Kosten von Enzymen ist wichtig, die Entwicklung eines wirtschaftlichen Lignocellulose Ethanol-Industrie. Die derzeit verfügbaren kommerziellen Enzym-Cocktails sind komplex und schlecht definierte Mischungen aus vielen Proteinen (Nagendran et al., 2009), und sie sind vorwiegend für den Einsatz auf den Säure-vorbehandelten Maisstroh angepasst. Um die Entwicklung besserer Enzym-Cocktails zu beschleunigen, haben mehrere Labors mit hohem Durchsatz-Plattformen für die Enzym-Entdeckung und Charakterisierung entwickelt. .; Decker et Roboter Abgabe von Enzymen und Biomasse Schlämmen, statistische Design of Experiments, und / oder automatisierten Bestimmung von Glc und Xyl (Berlin et al, 2007: Die Anstrengungen in diesem Bereich eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften auch in GENPLAT gefunden eingebaut al, 2009;. Kim et al, 1998;. King et al, 2009).. GENPLAT erweitert diese früheren Bemühungen, die meisten deutlich in der Komplexität der Enzym-Mischungen, die aus maximal 6-Komponenten analysiert werden kann inden früheren Studien an mehr als 16 in unserem neuesten Werk (Banerjee et al., 2010c). Weitere wichtige Merkmale der GENPLAT sind die Verwendung von einem Wulst Mischkammer (Paddel-Reservoir), dass stover Schlämme während der Abgabe der Schwebe zu halten kann; schonende Durchmischung während der Verdauung von end-over-end Rotation und automatisierte kolorimetrischen Bestimmung von Glu und Xyl.

Ausrüstungen und Software zum Einsatz: <ol><li> Design-Expert-Software, Version 8.0 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN) ( <a href="http://www.statease.com">http://www.statease.com</a> ) </li><li> Biomek FXP Laborautomation Workstation (Beckman-Coulter, Fullerton, CA) </li><li> Biomek FXP-Software, Version 3.3 (Beckman-Coulter, Fullerton, CA) </li><li> Paddle-Reservoir (Modell VP 756C-1P100, V &amp; P Scientific Inc., San Diego) </li><li> Platten, 96-tiefe (1,5-ml) gut (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK) </li><li> Durchstechbare CapMats (USA Scientific, Ocala, FL) </li><li> Rotierende Hybridisierung Inkubator (Modell 5420, VWR) </li><li> Swinging-Becherzentrifuge (Model 5810R, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) </li><li> Platten, Costar 96-well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK) </li><li> Platten, 384-well (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA) </li></ol> Verwendete Reagenzien: <ol><li> Pichia pastoris und Vektoren: strain X33 und pPICZ und pPICZα (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> T. reesei und Vektoren: strain QM9414 (US Department of Agriculture National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, IL) und pCB1004-EV (Banerjee et al, 2010b). </li><li> Accellerase 1000 (Lot-Nummer 1600844643) (Genencor, Inc., Rochester, NY) </li><li> 50 mM Natriumcitrat-Puffer, pH 4,8, </li><li> Tetracycline Lager: 10 mg / ml </li><li> Cycloheximid Lager: 10 mg / ml </li><li> GOPOD Assay-Kit, Katalog K-GLUC (Megazyme, Bray, Irland) </li><li> Xylose-Assay-Kit, Katalog K-Xylose (Megazyme, Bray, Irland) </li></ol>

genplat: eine automatisierte plattform für biomasse enzym-entdeckung und cocktail-optimierung

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

Die hohen Kosten von Enzymen für die Biomassezersetzung sind ein wesentliches Hindernis für die wirtschaftliche Umwandlung von lignocellulosehaltigen Rohstoffen in flüssige Verkehrskraftstoffe wie Ethanol. Wir haben eine integrierte Hochdurchsatzplattform namens GENPLAT zur Entdeckung und Entwicklung neuartiger Enzyme und Enzymcocktails für die Freisetzung von Zuckern aus unterschiedlichen Vorbehandlungs-/Biomasse-Kombinationen entwickelt. GENPLAT besteht aus vier Elementen: einzelnen reinen Enzymen, statistischem Versuchsdesign, robotergestützter Pipettierung von Biomassesuspensionen und Enzymen sowie automatisierter farbmetrischer Bestimmung der freigesetzten Glc- und Xyl-Mengen. Einzelne Enzyme werden durch Expression in Pichia pastoris oder Trichoderma reesei hergestellt oder chromatographisch aus kommerziellen Cocktails beziehungsweise aus Extrakten neuartiger Mikroorganismen gereinigt. Simplex-Gitter-Mischungsmodelle (fraktionale faktorielle Modelle) werden mithilfe kommerzieller statistischer Versuchsplanungssoftware erstellt. Enzymgemische hoher Komplexität werden mittels robotergestützter Pipettierung im 96-Well-Format zusammengestellt. Die Messung der freigesetzten Glc- und Xyl-Mengen erfolgt automatisiert durch enzymgekoppelte farbmetrische Assays. Optimierte Enzymgemische mit bis zu 16 Komponenten wurden an einer Vielzahl von Rohstoff- und Vorbehandlungskombinationen getestet.
GENPLAT ist anpassbar für Gemische aus reinen Enzymen, Gemischen kommerzieller Produkte (z. B. Accellerase 1000 und Novozym 188), Extrakten neuartiger Mikroben oder Kombinationen daraus. Zur Herstellung und Prüfung von Gemischen aus &tilde;10 reine Enzyme benötigen weniger als 100 &mu;g jedes Proteins und weniger als 100 Gesamtreaktionen, wenn mit einer endgültigen Gesamtladung von 15 mg Protein/g Glucan gearbeitet wird. Wir verwenden Enzyme aus verschiedenen Quellen. Enzyme können aus natürlichen Quellen wie Pilzkulturen (z. B. Aspergillus niger, Cochliobolus carbonumund Galerina marginata) oder sie können durch Expression der kodierenden Gene (aus der wachsenden Zahl mikrobieller Genomsequenzen gewonnen) in Wirtsorganismen wie E. coli, Pichia pastorisoder einen fadenförmigen Pilz wie T. reeseiProteine können auch aus kommerziellen Enzymcocktails (z. B. Multifect Xylanase, Novozyme 188) gewonnen werden. Eine zunehmende Zahl reiner Enzyme, darunter Glycosylhydrolasen, esterolytisch wirkende Zellwandenzyme, Proteasen und Lyasen, ist über kommerzielle Anbieter erhältlich, z. B. Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com) und PROZOMIX (www.prozomix.com).
Die Software Design-Expert (Stat-Ease, Inc.) wird verwendet, um Simplex-Raster-Designs zu erstellen und Reaktionen (in diesem Fall die Freisetzung von Glc und Xyl) zu analysieren. Die Mischungen enthalten 4–20 Komponenten, deren Anteile zwischen 0 und 100 % variieren können. Zu den Versuchspunkten gehören typischerweise die äußeren Eckpunkte sowie eine ausreichende Anzahl dazwischenliegender Punkte, um ein gültiges Modell zu generieren. In der Terminologie des Versuchsdesigns handelt es sich bei den meisten unserer Studien um „Mischungs“-Experimente, was bedeutet, dass die Summe aller Komponenten einer festgelegten Gesamtproteinzuladung entspricht (angegeben als mg/g Glucan). Die Anzahl der Mischungen im Simplex-Raster hängt sowohl von der Anzahl der Komponenten in der Mischung als auch vom Grad des Polynoms (quadratisch oder kubisch) ab. Beispielsweise umfasst ein Experiment mit sechs Komponenten 63 separate Reaktionen mit einem erweiterten speziellen kubischen Modell, das Dreifachwechselwirkungen erfassen kann, während nur 23 einzelne Reaktionen mit einem erweiterten quadratischen Modell erforderlich sind. Bei Mischungen mit mehr als acht Komponenten ist ein quadratisches Versuchsdesign praktikabler, und nach unserer Erfahrung sind solche Modelle in der Regel statistisch valide.
Alle Enzymmengen werden als Prozentsatz der endgültigen Gesamtmengen angegeben (die in unseren Experimenten typischerweise 15 mg Protein/g Glucan beträgt). Für „Kern“-Enzyme ist die untere Prozentschranke auf 5 % festgelegt. Diese Schranke leitet sich aus unseren Erfahrungen ab, wonach die Ausbeuten an Glc und/oder Xyl sehr gering waren, wenn eines der Kernenzyme in einer Konzentration von 0 % vorlag. Schlechte Modelle entstehen, wenn zu viele Proben sehr niedrige Glc- oder Xyl-Ausbeuten zeigen. Die Festlegung einer unteren Grenze bestimmt zugleich eine obere Grenze. Das heißt, bei einem Experiment mit sechs Komponenten beträgt, wenn die untere Grenze für jede einzelne Komponente bei 5 % liegt, die obere Grenze jeder einzelnen Komponente 75 %. Die unteren Grenzen für alle anderen als „zusätzlich“ betrachteten Enzyme sind auf 0 % festgelegt. Die Bezeichnungen „Kern“ und „zusätzlich“ sind teilweise willkürlich und variieren je nach Substrat, aber in unseren Studien umfassen die Kernenzyme zur Freisetzung von Glc aus Maisstover die folgenden Enzyme aus T. reesei: CBH1 (auch bekannt als Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1(Cel7B), BG (β-Glucosidase), EX3 (Endo-β1,4-Xylanase, GH10) und BX (β-Xylosidase).
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GENPLAT (GLBRC Enzyme Platform) ist eine automatisierte Plattform für die Entdeckung und Optimierung von Enzym-Cocktails für Biomasse Abbau. Es kann zu mehreren Rohstoffen und Mischungen von Enzymen, die mehrere Komponenten angepasst werden.

GENPLAT: eine automatisierte Plattform für Biomasse Enzym-Entdeckung und Cocktail-Optimierung

Die hohen Kosten für Enzyme zum biologischen Abbau von Biomasse stellen ein erhebliches Hindernis für die wirtschaftliche Umwandlung von lignocellulosehaltigen Rohstoffen in flüssige ...

Bei diesem Verfahren werden Enzymgemische zur Umwandlung von Lignocellulose-Biomasse in freie Zucker mithilfe eines automatisierten Systems, bekannt als A-G-L-B-R-C-Enzymplattform oder gen plat, optimiert. Zunächst wird ein Mischungsmodell entworfen, bei dem vier bis 18 unterschiedliche Enzyme mit Hilfe von Versuchsplanungssoftware in bis zu 96 verschiedenen Verhältnissen kombiniert werden. Anschließend werden die Biomasse und die Enzyme mittels eines Robotersystems für die Flüssigkeits-handhabung in 96er-Tieflochplatten pipettiert.Die Platten werden verschlossen und 48 Stunden bei 50 Grad Celsius inkubiert. Nach der Inkubation werden die Vertiefungen mithilfe eines automatisierten Flüssigkeitsmanagementsystems entnommen, und die freien Glucose- und Xylosekonzentrationen werden mittels einer farbmetrischen, enzymgekoppelten Assaymethode gemessen. Anschließend wird mit Hilfe von Versuchsplanungssoftware ermittelt, welche Kombinationen von Enzymen die maximale Menge an freier Glucose und Silosen liefern.Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Effizienz verschiedener Enzymcocktails zur gleichzeitigen Umwandlung von Lignocellulose-Biomasse in fermentierbare Zucker für Ethanol zu testen, wobei das langfristige Ziel darin besteht, die Produktionskosten für Biokraftstoffe zu senken. Obwohl wir diese Methode hauptsächlich zur Analyse von Enzymcocktails an alkalisch vorbehandeltem Maisbrennrest verwenden, kann sie an jede Vorbehandlung und jede Rohstoffart angepasst werden, beispielsweise an säurebehandelte Pappel, Schilfgras oder getrocknete Destillationsrückstände. Mithilfe dieser Technik können neuartige Enzyme entdeckt werden, die für den Abbau von Biomasse wichtig sind, sowie verbesserte Varianten bereits bekannter Enzyme identifiziert werden.Obwohl die für Gem-Plats verwendeten Enzyme aus verschiedenen Quellen stammen können, werden die in dieser Demonstration verwendeten Enzyme durch Expression von PPIC oder PPIC alpha in Pia Pastis gro-Zellen in 300-Milliliter-Ansätzen in 500-Milliliter-Kolben mit Baffeln über drei Tage hinweg produziert. Anschließend wird vier Tage lang alle 24 Stunden nach dem letzten Tag der Methanolinduktion eine Methanolinduktion durchgeführt. Die Proben werden dann in ein Tangentialflussfiltrationssystem mit einer Membran mit 10 Kilodalton Cutoff überführt, um die Kultur zu konzentrieren und zu entsalzen.Die Filtrate werden anschließend einer Pufferaustauschung mit fünf Volumina 25 Millimolar Natriumacetat, pH 5, unterzogen und die Probe konzentriert, um das Volumen auf 10 bis 25 Milliliter zu bringen. Bestimmen Sie den Proteingehalt mittels der BCA-Methode unter Verwendung von BSA als Standard; die Endkonzentration der Enzym-Stammlösungen sollte zwischen 0,5 und 10 Milligramm pro Milliliter liegen. Lagern Sie die Enzyme in kleinen Aliquoten mit 20 % Glycerin bei minus 80 Grad Celsius, um Simplex-Lattice-Designs zu erstellen.Öffnen Sie zunächst das Design-Expert-Programm auf einem PC. Geben Sie die Anzahl der zu testenden Enzyme sowie die oberen und unteren Anteile ein. Beispielsweise beträgt der untere Anteil 5 % für Kernenzyme. Anschließend geben Sie an, ob das experimentelle Design quadratisch oder kubisch ist.Quadratisch ist bei Mischungen mit mehr als acht Komponenten in Excel erforderlich. Berechnen Sie die Menge in Mikrogramm jedes Enzyms, die zugegeben werden muss, um insgesamt 15 Milligramm pro Gramm Glucan pro Probe aufzuladen. Berechnen Sie anschließend die Menge jedes Enzyms in Mikrolitern, die jeder Reaktion basierend auf den Proteinkonzentrationen der Stammlösungen zuzusetzen ist.Erstellen Sie zus&auml;tzliche Excel-Arbeitsbl&auml;tter, in denen die Quellwells im LabWare-System, das Ziel-LabWare, die Zielwells und die &Uuml;bertragungsvolumina f&uuml;r die Dosierung von Wasser und Enzymen gem&auml;&szlig; dem Versuchsdesign festgelegt werden. Importieren Sie anschlie&szlig;end das Arbeitsblatt in die Biome FX-Software mithilfe der Funktion &bdquo;&Uuml;bertragung aus Datei&ldquo;, um einen vorbehandelten Maisstover-Biomasseschlamm zu erzeugen. Geben Sie die getrocknete Biomasse in eine Wiley-M&uuml;hle und mahlen Sie sie, bis sie ein 0,5-Millimeter-Sieb passiert.Sammeln Sie die Bodenbiomasse in einem Becher. Der Glucangehalt wird mit Standardmethoden gemessen, wie in der JoVE-Publikation „Umfassende zusammensetzungsmäßige Analyse von Pflanzenzellwänden, Teil eins: Lignin“ beschrieben. Sobald der Glucangehalt bestimmt wurde, mischen Sie die Biomasse mit Zitratpuffer, sodass die endgültige Glucankonzentration 0,5 % beträgt. Schalten Sie das Rührwerkreservoir ein und gießen Sie die Biomassesuspension hinein.Obwohl die Enzyme jetzt auf Eis sind, hängt die Menge jedes Enzyms von der Größe des Experiments zur Abgabe von Biomasse ab. Um Aufschlämmungen herzustellen, werden breite Pipettenspitzen verwendet, indem man mit einer Rasierklinge die letzten 0,5 Zentimeter der Spitze abschneidet. Acht 100-Mikroliter-Pipettenspitzen.Die beschnittenen Span-Acht-Spitzen können wiederverwendet werden. Nach dem Beschneiden sollten die Spitzen in eine Pipettierbox eingelegt werden, damit sie automatisch von der SPAN eight aufgenommen werden können. Dieses Gerät ist mit einer SPAN-eight-Pod mit einer Einwegspitzenfunktion ausgestattet, die individuelle Lösungen in einzelne Vertiefungen abgeben kann, sowie mit einer festen AP-96-Pod, die 96 identische Lösungen gleichzeitig in eine 96-Loch-Platte übertragen kann. Danach sollte das Deck des Flüssigkeitsmanagementsystems angeordnet werden.Dies umfasst eine 96er-Tiefloch-Reaktionsplatte, einen Deckel mit Auffangbehälter für Wasser, einen Enzymhalter mit den Enzymen in 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen sowie mehrere volle Pipettenspitzenkästen an den vorgesehenen Positionen auf dem Deck, wie im Geräte-Setup programmiert. Sobald das Deck bereit ist, überprüfen Sie das Programm auf eventuelle Fehler. Starten Sie den Beckman fx.Der achtarmige SPAN pipettiert zunächst 200 Mikroliter der Biomassesuspension in jedes Loch der 96-Loch-Tiefbrunnen-Reaktionsplatten. Danach gibt die achtarmige SPAN-Patrone Enzyme in jedes der Löcher gemäß der in die Biome-FX-Software importierten Tabellenkalkulation ab. Sobald das Pipettieren abgeschlossen ist, entfernen Sie die 96er-Tiefbrunnenplatte vom Deck. Versiegeln Sie die Platte mit einem Pi- oder Kapillarmat. Danach drehen Sie die Platte um und klopfen sie ein- oder zweimal, um die Oberflächenspannung zu brechen. Stellen Sie die Platte nach der Inkubationszentrifugation 48 Stunden lang in den Hybridisierungsofen.Die 96er Steilbodenplatte drei Minuten lang bei 1.500 × g in einem Schwenkkorbzentrifugen zentrifugieren, während die Platte rotiert. Programmieren Sie das Beckman FX-Gerät, um mit der AP-96-Pipettierplattform 100 Mikroliter aus jedem Loch in eine Standard-96-Loch-Platte zu übertragen. Nach der Zentrifugation die Platte in das Gerät einsetzen und das Pipettieren starten.Wenn das Pipettieren abgeschlossen ist, inkubieren Sie die Platten 10 Minuten lang bei 100 Grad Celsius auf einem Plattenheizgerät, um die Enzyme zu inaktivieren, und zentrifugieren Sie die Platte anschließend 30 Sekunden lang mit 1.500 × g. Für die GLC-Messungen geben Sie zunächst 192 Mikroliter der Glucose-Oxidase-Peroxidase-Reagenzien zu, und verwenden Sie dazu ein Programm, das für die AP-96-Pod-Einheit des Beckman-fx-Geräts erstellt wurde.Verwenden Sie dann die AP 96-Pod, um 12 Mikroliter des Sate in eine gewöhnliche 96-Well-Platte zu überführen. Inkubieren Sie die Platten 20 Minuten bei 50 Grad Celsius und messen Sie die Absorption bei 510 Nanometern in einem Mikroplatten-Reader. Für Xlo-Messungen fügen Sie die Assay-Reagenzien gemäß den Anweisungen des Kits hinzu.Verwenden Sie dann die AP 96-Pod, um vier Mikroliter aus jedem Well in 384-Well-Platten zu überführen, und messen Sie die Absorption bei 340 Nanometern. Führen Sie die Datenanalyse wie in dem begleitenden Dokument beschrieben unter Verwendung der Design-Expert-Software durch. Fünf Substrate und drei Vorbehandlungen wurden unter ähnlichen Bedingungen verglichen: Mahlung auf eine Partikelgröße von 0,5 Millimeter, Enzymladung von 15 Milligramm pro Gramm Glucan und Hydrolysebedingungen.48 Stunden bei 50 Grad Celsius, wie hier zu sehen ist. Es gibt auffällige Unterschiede zwischen Rohstoffen und Vorbehandlungen. Deutlich ist, dass die Enzymkocktail-Beschleunigung allein 1000 nicht mit der gesamten Variabilität bei Vorbehandlungen und Rohstoffen zurechtkommt.Dieses Experiment vergleicht einen mit A FEX vorbehandelten Maisbrennholz, der als A-F-E-X-C-S bezeichnet wird, mit alkalischer Peroxid-Vorbehandlung behandeltes Maisbrennholz, A-H-P-C-S, und mit A FEX vorbehandelte getrocknete Destillationsrückstände, A-F-E-X-D-D-G. Die Zahlen an der Oberseite der Balken geben die Glucoseausbeute als Prozentsatz der gesamten Glucose in der Biomasseprobe an. Beachten Sie, dass sich die Zusammensetzung der Cocktails je nach Vorbehandlung und Biomassesubstrat erheblich unterscheidet.Obwohl der Hauptzweck von gem plat darin besteht, synthetische Gemische reiner Enzyme herzustellen, kann es auch zur Herstellung optimierter Gemische kommerzieller Enzympräparationen verwendet werden. Abbildung A zeigt ein Diagramm mit vier Enzymen, die für die Freisetzung von Glukose aus A-F-E-X-D-D-G optimiert wurden; Abbildung B zeigt die resultierenden Ausbeuten mit diesem optimierten Gemisch im Vergleich zu drei anderen Enzympräparationen. Wir haben soeben die Anwendung von gen plat zur Unterstützung des Biomasseabbaus unter Verwendung einzelner reiner Enzyme demonstriert.Jedes Enzym weist eine spezifische katalytische Aktivität auf, die zur vollständigen Zersetzung von Pflanzenzellwänden in einzelne Zucker beiträgt. Um jedoch die Bedeutung eines Enzyms bei der Biomassezersetzung zu bewerten, ist es nicht erforderlich, seine genaue katalytische Aktivität zu kennen. Mithilfe von Gen pla ist es entscheidend, zu wissen, welche Enzyme wichtig sind und in welchen Anteilen, um die biotechnologische Erforschung gezielt zu steuern.Für neue Enzyme in der Proteinengineering und für die Entwicklung von Organismen für die konsolidierte biotechnologische Verarbeitung sind die Ergebnisse manchmal überraschend. Beispielsweise stellten wir fest, dass bei der Freisetzung von Glukose aus Conover eine Kombination zweier nicht verwandten Xin-Ais der Verwendung von Xin allein überlegen ist. Außerdem fanden wir heraus, dass eine bessere Manase für die Freisetzung von Glukose aus trockenem Destillationsrückstand wichtig ist.Auch wenn dieses Material einen geringen Betterman und Gehalt aufweist, wird diese Methode den Forschern den Weg ebnen, noch bessere Enzymcocktails für eine Vielzahl von Bedingungen zu entwickeln. Sie müssen nicht einmal wissen, welche enzymatische Funktion ein bestimmtes Protein hat, um dessen Beitrag zum Abbau von Lignocellulose zu testen.

genplat-an-automated-platform-for-biomass-enzyme-discovery-cocktail

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Ein High-Throughput-Screen für Biomining Cellulase Aktivität von Metagenombanken

Eine einfache, schnelle Methode zur Bestimmung der Verzuckerung Potenzial einer großen Zahl von pflanzlicher Biomasse Proben beschrieben. Die automatisierte Plattform für diese Analyse umfasst die Vorbereitung der pflanzlichen Biomasse für die Analyse in 96-Well-Platten und die anschließende Performance der Vorbehandlung, Hydrolyse und Quantifizierung der Zucker freigesetzt.

High-Throughput-Assay Verzuckerung für Lignocellulose-Materialien

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Hochdurchsatz-Screening von Kohlenhydrat-abbauenden Enzymen Neuartige Unlöslich chromogenen Assays Kits

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