Der Aufbau eines Low-Budget-Laser Axotomie System, um Axon Regeneration in Study C. elegans

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu zeigen, wie ein Laserablationssystem zur Untersuchung der Axonregeneration in KL gans zusammengebaut und ausgerichtet werden kann. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Laserverschraubung, ein Thompson-Polarisator, eine Halbwellenplatte, ein Drehspiegel, eine Periskopschiene und ein Schienenspiegel auf einem Steckbrett montiert werden. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, den Laserstrahl auf den von der Kondensorlinse des Mikroskops ausgehenden Strahl auszurichten.

Dann wird die Laserstrahlaufweitungslinse montiert, ausgerichtet und positioniert, um den Laserstrahl zu zentrieren und ihn auf null Divergenz zu bringen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, den Laserablationsfleck durch Feinjustierungen kongruent mit dem Bildfokus zu machen. Letztendlich ist es möglich, Axone von halben Mikrometern mit minimaler kollateraler Gewebeschädigung mit dem beugungsbegrenzten Laserstrahl präzise zu schneiden, wenn es sich um eine unvollkommene XY-NC-Ausrichtung handelt.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Femto-Sekundenlasern besteht darin, dass sie mit 15.000 relativ kostengünstig ist. Es ist relativ wartungsfrei und bietet ein sehr präzises Axonschneiden. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Regeneration von Seeelgan-Axonen geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie Fliegen, Zebrafische, Mäuse, das periphere Nervensystem und die In-vitro-Zellen angewendet werden.

Im Grunde jede Zelle, die sich innerhalb von 30 bis 50 Mikrometern von der Oberfläche befindet. Beginnen Sie mit den Komponenten, die auf dem Steckbrett positioniert sind, und schrauben Sie den Laserperiskoppfosten und die erhöhten Schienenstützen fest. Dieses System verwendet einen Laser der Klasse drei B, der Ihre Augen leicht schädigen kann, also nehmen Sie bitte die Sicherheit von Lasern ernst.

Sprechen Sie mit jemandem in Ihrer örtlichen Physikabteilung darüber, wie Sie sicher mit Freistrahllasern arbeiten können. Stellen Sie den Laser während des Ausrichtungsvorgangs immer auf die niedrigste Leistung ein. Wenn Sie durch das Okular schauen, stellen Sie sicher, dass der Laser mechanisch geschlossen und ausgeschaltet ist.

Positionieren Sie nun zuerst das Mikroskop und richten Sie es an der Schienenachse aus. Richten Sie es zweitens auf den durchgelassenen Lichtstrahl der Kondensorlinse des Mikroskops aus. Drittens: Richten Sie beide Enden der Schiene mit einer einstellbaren Blende oder Linse, die an der Schiene befestigt ist, am Kondensorstrahl aus.

Verwenden Sie eine Wasserwaage und Laborheber, um die Schienenhöhe einzustellen, bevor Sie fortfahren. Stellen Sie sicher, dass beide Enden der Schiene ausgerichtet sind. Stellen Sie nun sicher, dass der Laserstrahl durch die Drüse, den Thompson-Polarisator und die Halbplatte dringt und nicht rotierend auf deren Kanten trifft.

Die Halfway-Platte passt die Leistung des Lasers an, wobei alle Komponenten auf dem Steckbrett befestigt sind. Schalten Sie den Laser ein, stellen Sie die Pulsfrequenz auf 100 Dauerbetrieb ein und reduzieren Sie die Leistung mit der Halbtaktplatte auf ein Minimum. Verwenden Sie einen Post-it-Zettel oder Linsenpapier, um den Laserstrahl zu visualisieren.

Nun geht es darum, den Laserstrahl vom Steckbrett nach oben zu bringen. Justieren und fixieren Sie die kinematisch montierten Spiegel nacheinander vom Laser aus, um den Strahl zu dem Spiegel zu bringen, der am Ende der Hochschiene montiert ist. Wenn Sie fertig sind, sollte der Laserstrahl ungefähr auf die Mitte der Spiegel ausgerichtet werden, und die Spiegel sollten ungefähr 45 Grad zur Laserstrahlachse ausgerichtet sein, bevor der Laserstrahl mit dem Durchlichtstrahl des Mikroskops ausgerichtet wird.

Entfernen oder öffnen Sie alle ND-Filter und Blenden im Zwischenmodul. Wir beginnen nun mit dem wichtigsten Schritt, um ein präzises Schneiden von Axonen ohne übermäßige Kollateralschäden zu ermöglichen. Wir richten den Laser genau auf der x-, y- und z-Achse mit der geringsten Laserleistung aus, um den kleinsten Ablationspunkt zu erhalten.

Der Laser und die transmittierten Lichtstrahlen sind gleichzeitig auf Papier zu sehen. Positionieren Sie das Papier in der Nähe des Mikroskopanschlusses, um zu beginnen. Beginnen Sie nun mit dem Ausrichten des Lasers mit den Kurseinstellungen am Spiegel oben auf dem Periskop und dem Spiegel am Ende der Schiene.

Legen Sie ein Papier zwischen die ausgerichtete Kondensorlinse und den offenen Objektivrevolver. Fahren Sie mit den Feineinstellungen am Schienenspiegel fort, um den Laserstrahl auf die Mitte des größeren Durchlichtstrahls auszurichten. Befestigen Sie nun das Mikroskop mit Klammern.

Weitere Schritte zur Beurteilung der Ausrichtung des Lasers finden Sie im schriftlichen Manuskript. Zwei Galilean-Strahlaufweiter müssen installiert werden, um den 300-Mikron-Laserstrahl um das 33-fache zu erweitern, um die hintere Öffnung des 10-Millimeter-Objektivs zu füllen. Beginnen Sie mit der Montage der vier Objektive auf Trägern.

Befestigen Sie dann die Linsen so an der Schiene, dass sie alle auf der gleichen optischen Achse und genau orthogonal zum Laserstrahl stehen. Schalten Sie den Laser ein und stellen Sie ihn auf minimale Leistung und Dauerbetrieb ein. Passen Sie die Strahlausrichtung durch jede Linse grob an.

Verwenden Sie Papier, um den Strahl zu sehen. Schalten Sie nun den Laser aus. Bringen Sie einen Sicherheitsverschluss am Laser an und entfernen Sie das Mikroskop aus dem Weg des Laserstrahls.

Schalten Sie den Laser wieder ein und visualisieren Sie ihn an einer Wand in der Nähe. Nutzen Sie die Feineinstellung der Linsen, um den Strahl zu erweitern. Stellen Sie dann die letzten beiden kinematisch montierten Spiegel so ein, dass der Strahl in einem Kreis mit gleichmäßiger Helligkeit an der geschätzten Position der hinteren Blende des Objektivs ausgerichtet ist.

Zeigen Sie die Größe und Gleichmäßigkeit des Strahls auf Papier an. Stellen Sie dann den Strahl auf Nullkonvergenz ein, indem Sie notieren, wie sich die Strahlgröße ändert, wenn das Papier weiter von der Linse entfernt wird. Schalten Sie den Laser aus und betätigen Sie den mechanischen Verschluss.

Schieben Sie das Mikroskop mit den festen Klemmen zurück in den Laserstrahlengang, um die richtige Ausrichtung zu definieren. Bringen Sie die Klemmen an der freien Seite des Mikroskops wieder an, aber ziehen Sie sie nicht fest. Schalten Sie nun den Laser ein.

Entfernen Sie den Sicherheitsverschluss und drehen Sie den Objektivrevolver mit Papier auf dem Tisch in eine offene Position, und der ausgebreitete und gleichmäßige Laserstrahl, der auf den durchgelassenen Lichtstrahl aus dem Kondensor zentriert ist, sollte sichtbar sein. Wenn sie nicht zentriert sind, zentrieren Sie die Strahlen, indem Sie die Mikroskopklemmen lösen und das Mikroskop vorsichtig anstoßen. Löse nun den Sicherheitsauslöser ein und stelle den Laser in den Trigger-Modus.

Drehen Sie das 60-fache Objektiv an Ort und Stelle. Nun Bild der Oberflächenkratzer auf einer Zielfolie. Entfernen Sie den Sicherheitsverschluss, lösen Sie den Ablationslaser aus und stellen Sie die Laserleistung auf den minimalen Ablationspunkt ein.

Der Fleck sollte kreisförmig sein und innerhalb von fünf bis 10 Mikrometern von der Bildmitte, der Mitte, dem Ablationsfleck liegen. Mit den Feineinstellungen des kinematisch montierten Schienenspiegels, um den Spot zentriert und das Strahlprofil gleichmäßig zu halten, ist es notwendig, den Schienenspiegel und den oberen Periskopspiegel iterativ anzupassen. Bewerten Sie den Z-Fokus des Lasers, indem Sie den Fokus systematisch in Ein-Mikron-Schritten auf und ab bewegen und den Ablationslaser bei jedem Schritt auslösen.

Wenn der Strahl korrekt gedehnt und ausgerichtet ist und die Konvergenz korrekt eingestellt ist, sollte er maximal bei der Bildschärfe abtragen und schwach oder gar nicht, ein Mikrometer über oder unter der Schärfe. Wenn der maximale Ablationsfleck über oder unter dem Bildfokus liegt, nehmen Sie die letzten Anpassungen am Z-Fokus des erweiterten Strahls vor, indem Sie die Linse L drei des Galileischen Teleskops bewegen, bis die Laserablation mit dem Bildfokus kongruent ist. Nematoden wurden auf einen maßgeschneiderten Objektträger montiert und Axone wurden mit dem konstruierten System abgetragen. Die Laserexosomie und die Zeitrafferbildgebung der Axonregeneration waren sehr robust.

Mit Hilfe eines motorisierten Tisches war es möglich, fünf Axone bei fünf verschiedenen Tieren routinemäßig und präzise zu schneiden und abzubilden. Auf einer einzigen Folie. Die Bildgebungszeit für Axone war der limitierende Faktor.

Etwa 10 % der Experimente produzierten qualitativ hochwertige Zeitrafferfilme. Die restlichen Experimente lieferten allesamt gute Daten, waren aber ästhetisch weniger ansprechend, da der Wurm in der Regel nach fünf bis acht Stunden Immobilisierung mit kleinen Zitterbewegungen begann. Bei diesem Verfahren ist es immer wichtig, die Ausrichtung des Lasers in der x-, y- und z-Achse genau zu bewerten.

Das häufigste Problem, das Menschen haben, die versuchen, Axone zu schneiden, sind Kollateralschäden oder die völlige Unfähigkeit, Axone zu schneiden, und dies ist fast immer auf einen falsch ausgerichteten Laser zurückzuführen. Dieses Laserablationssystem und die Technik zur Visualisierung der Axonregeneration in c Agains ermöglichen es Ihnen, die Auswirkungen genetischer Mutationen auf die Axonregeneration routinemäßig zu testen. NCL Agains.