Name: Produktion und Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Cancers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Lernen Sie die Detektion reaktiver Sauerstoffspezies in Zellkulturen mit fluoreszierenden Farbstoffen und lumineszenten Assays. Diese Methoden ermöglichen die Bewertung oxidativen Stresses und zellulärer Redox-Zustände.

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Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health (CA142664) unterstützt.

1. Detektion von ROS mit Carboxy-H 2 DCFDA Carboxy-H 2 DCFDA ist nicht fluoreszierenden, aber in Anwesenheit von ROS, wenn dieses Reagenz oxidiert wird, wird es grün fluoreszierend. <ol><li> Unmittelbar vor der Verwendung, eine frische Stammlösung von Carboxy-H 2 DCFDA in sterile Dimethylsulfoxid (DMSO) oder 100% Ethanol. Vermeiden Sie mehrere Tau-/ freeze-Zyklen Ihrer Farbstoff. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit HEPES gepufferte Salzlösung (HBSS) oder Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), um Spuren der ursprünglichen Medium zu entfernen. </li><li> Laden Sie die Zellen mit dem Farbstoff (und die Kontrolle Farbstoff, vgl. Anm. Abschnitt). In diesem Test verwendeten wir Jurkat, einer menschlichen Leukämie-Zelllinie. Verwenden Sie Carboxy-H 2 DCFDA in einer Endkonzentration von 1 &amp;mgr; in regelmäßigen Kulturmedium mit reduzierter Serum (2%). </li><li> Inkubieren Sie die Kulturen für 30 Minuten im Dunkeln, in einer konventionellen Inkubator (37 ° C, 5% CO2). Entsorgen Sie alle unbenutzten Farbstofflösungen. </li><li> Entfernen carboxy-H 2 DCFDA Medium und waschen zweimal mit HBSS oder PBS. Von diesem Schritt, schützen Sie Ihre Zellen aus Licht. </li><li> Fügen Sie frisches Medium mit Ihrem Medikament der Wahl zum Carboxy-H 2 DCFDA-beladenen Zellen und inkubieren, wie gewünscht. Für dieses Beispiel verwenden wir H 2 O 2 (0,03%) für 1 Stunde. </li><li> Bewerten ROS durch eine sofortige Analyse Ihrer Zellen mittels Durchflusszytometrie mit dem FL1-Kanal (grüne Fluoreszenz), oder durch Fluoreszenz-Reader oder durch Fluoreszenz-Mikroskopie. Die Fluoreszenz kann durch Anregungs-und Emissionswellenlänge, die sich für grüne Fluoreszenz nachgewiesen werden. </li></ol> Hinweis: Die Kontrollen sollten Carboxy-H 2 DCFDA-geladen unbehandelten Zellen und ungefärbten unbehandelten Zellen beinhalten. Carboxy-H 2 DCFDA ist bekannt, Peroxide erkennen, sondern könnten auch durch andere ROS oxidiert werden. Dieses Reagenz kann auch durch andere Mittel geändert werden, Oxidation unempfindlich Kontrolle Farbstoff wie 5 - (und-6)-Carboxy-2 ', 7'-Dichlorofluorescein Diacetat (Carboxy-DCFDA) sollte daher in den Test einbezogen werden. 2. Messung von Stickstoffmonoxid (NO)-Produktion Sie müssen Sulfanilamid und N-1-napthylethylenediamine dihydrochlorid (NED)-Lösungen, und Nitrit-Standard. Dieser Test wird als Griess-Assay. NED: Mach eine 0,1% ige Lösung von N-1-napthylethylenediamine dihydrochlorid in sterile water.Sulfanilamide verdünnt: Machen Sie eine 1% ige Lösung von Sulfanilamid in 5%-iger Phosphorsäure verdünnt. Nitrit Standard: Verdünnen Sie die 0,1 Standard-Lager Natriumnitrit zu 100 &amp;mgr; in steriles Medium, keine serielle Verdünnung in dem gleichen Medium. Lagerbedingungen: Chemikalien, die als vom Hersteller bei Raumtemperatur geleitet. Nach dem Auflösen sind NED und Sulfanilamide Lösungen sofort nach Gebrauch bei 4 ° C gelagert, in der Dunkelheit, und für maximal 3 Monate. <ol><li> Kultur-Zellen in einer 96-Well-Platte,Verwendung dreifach für jede Bedingung und umfassen angemessene Kontrollen nach Ihren Experimenten. </li><li> Gönnen Zellen die NO-Produktion zu induzieren. In unserem Experiment nutzen wir Lipopolysaccharid (LPS) (100 ng / ml) und rekombinantem IL-4, um unsere Zellen zu behandeln. In diesem Protokoll verwendeten wir RAW 264.7, eine Maus-Makrophagen-Zelllinie (Maus leukämischen Monozyten-Makrophagen-Zelllinie). </li><li> Am Tag des Tests, bringen beide Reagenzien auf Raumtemperatur. </li><li> Spin Ihrem Teller, sammeln Zellüberständen und Transfer 50 ul, um eine neue 96-Well-Platte. Bereiten Grenzverdünnung Brunnen Ihrer Standard-Stammlösung zu einer Standard-Kurve machen. </li><li> Add 50 ul Sulfanilamide Lösung für jede Probe und Kontrolle gut und gut mischen. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 Minuten im Dunkeln. </li><li> Add 50 ul N-1-napthylethylenediamine dihydrochlorid Lösung für jede Probe und Kontrolle gut und gut mischen. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 Minuten im Dunkeln. </li><li> Messen ABSORBAnce sofort mit einem Platten-Lesegerät mit Filter der Wellenlängen zwischen 520nm und 550nm. </li></ol> Wenn Sie verschiedene Teller / Schale Größen nutzen, verwenden 1/1/1 Lautstärke für jede Lösung und Probenüberstand. Eine violette Farbe wird in der positiven Vertiefungen erscheinen. Ergebnisse mit dem Standard erhalten wird Ihnen helfen, prüfen Sie die Stabilität Ihres Lösungen. 3. Detektion von ROS Aktion: oxidierten Proteinen Eine andere Methode, um die Produktion von ROS zu identifizieren, ist am Ende Ergebnisse durch den Nachweis der Oxidation von Proteinen zu suchen. In der Tat spielt ROS ändern Glutathion, ein Antioxidans, das in den meisten Zellen exprimiert wird und eine schützende Rolle gegen ROS. Nach Oxidation durch ROS, Änderung des reduzierten Glutathion (GSH) Ergebnisse in der Sulfhydryl (Thiol)-Gruppe der Cystein mit einem zweiten Glutathion über eine Disulfidbrücke verbunden. Dies führt zu der Bildung eines dimerisierten Protein (oxidierte Protein GSSG). GSH kann über Modifikation von GSSG durch das Enzym Glutathion-Reduktase wiederhergestellt werden. Der Anstieg des GSSG / GSH-Verhältnis spiegelt oxidativen Stress. Die folgenden Test basiert auf der Detektion und Quantifizierung dieser oxidierten Proteinen. Diese Methode ist nicht für spezifische ROS selektive, sondern erkennt die Auswirkungen von NO, H 2 O 2, O 2 - und andere ROS. Hier messen wir die Gesamtmenge der oxidierten (GSSG) und reduziertem (GSH) Glutathion mit Biolumineszenz-Signale. <ol><li> Seed Ihre Zellen in einer 96-Well-Platte (weiß / transparent, flache Böden) wie gewohnt. Für unser Experiment haben wir 1x10 4 Zellen pro Well für adhärente RAW 264.7 und A549-Zellen und Fahrwerk Jurkat-Zellen. Je nach Größe Ihrer Zellen diese Zahlen weiter angepasst werden kann. Wir empfehlen die Platte anhaftenden Zellen am Tag vor dem Test, damit sie auf die Platte zu befestigen. Genug Vertiefungen sollten für oxidierte und reduzierte Protein-Erkennung sowie für "medium nur" vorbereitet werden undunbehandelte Zellen als Kontrolle. Verwenden Sie dreifach für alle Bedingungen. </li><li> Verwöhnen Sie Ihre Zellen mit Ihrem Medikament für die erforderliche Zeit. Hier haben wir behandelt, Jurkat-Zellen und A549 Zellen für 1h mit H 2 O 2 (bei ​​5 mm und 2,5 mm bzw.). RAW 264.7 Zellen wurden mit 200ng/ml LPS für 16 h behandelt Während dieser Inkubationszeit, bringen alle Ihre Reagenzien auf Raumtemperatur (RT). Nehmen Sie alle Reagenzien nicht mehr als 30 Minuten vor der Durchführung des Tests. Die folgende Tabelle zeigt die Volumina der Reagenzien pro Vertiefung. Wenn möglich, ist es wichtig, die Medien mit dem Reduktionsmittel, bevor Sie mit dem Test zu entfernen. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="2"> Adhärenten Zellen </td><td colspan="2"> Suspensionszellen </td></tr><tr><td> Insgesamt Glu Lysis </td><td> Oxidierte Glu Lysis </td><td> Insgesamt Glu Lysis </td><td> Oxidierte Glu Lysis </td></tr><tr><td> NEM, 25mm </td><td> keiner </td><td> 0.5μl </td><td> keiner </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> Luciferin-NT </td><td> 1 ul </td><td> 1 ul </td><td> 1 ul </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Passive Lysis Buffer, 5X </td><td> 10 &amp;mgr; l </td><td> 10 &amp;mgr; l </td><td> 10 &amp;mgr; l </td><td> 10 &amp;mgr; l </td></tr><tr><td> Destilliertes Wasser </td><td> 39.0μl </td><td> 38.5μl </td><td> 14μl </td><td> 13.5μl </td></tr><tr><td> Das endgültige Volumen pro Well </td><td> 50 ul </td><td> 50 ul </td><td> 25 &amp;mgr; l </td><td> 25 &amp;mgr; l </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Entfernen Sie Medium aus Brunnen mit adhärenten Zellen. Entfernen Sie nicht mittelfristig in Brunnen mit Suspensionszellen. </li><li> Add reduziertes Glutathion Lyse-Reagenz oder oxidiertem Glutathion Lysereagens in die entsprechenden Wells und schütteln für 5 Minuten bei RT. </li><li> Fügen Sie die Luciferin Generation Reagenz und INCUBATe für 30 Minuten bei RT. </li><li> Fügen Sie die Luciferin Nachweisreagenz und Inkubation für 15 Minuten bei RT. </li><li> Lesen Sie die Biolumineszenz-Signal an Integrationszeit von 0,25-1 Sekunde pro auch mit einem Platten-Lesegerät Luminometer. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Adhärenten Zellen </td><td> Suspensionszellen </td></tr><tr><td> Die Zellzahl pro Well </td><td> 1x10 4 </td><td> 1x10 4 </td></tr><tr><td> Zellsuspension pro Well + Drogen </td><td> 100 ul, vor 3,4 entfernt werden </td><td> 25 &amp;mgr; l, darf nicht entfernt werden </td></tr><tr><td> Reduziertes Glutathion Lysereagens </td><td> 50 pl </td><td> 25 &amp;mgr; l </td></tr><tr><td> Oxidiertem Glutathion Lysereagens </td><td> 50 pl </td><td> 25 &amp;mgr; l </td></tr><tr><td> Luciferin-Generation Reagent </td><td> 50 pl </td><td> 50 pl </td></tr><tr><td> Luciferin Nachweisreagenz </td><td> 100 ul </td><td> 100 ul </td></tr></tbody></table> 4. Repräsentative Ergebnisse: <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3357/3357fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1: Nachweis von ROS mit Carboxy-H2DCFDA Farbstoff. Jurkat-Zellen (humane Leukämie-Zelllinie) mit H 2 O 2 behandelt wurden, zu nicht behandelten Zellen im Vergleich. ROS induziert die Änderung der Carboxy-H 2 DCFDA, dass grüner fluoresziert wie mittels Durchflusszytometrie, die fluoreszierende Gipfel in H 2 O 2 behandelten Zellen bis zu den Gipfeln in der Kontrollgruppe (H 2 O 2 behandelten Zellen gefärbt mit Oxidations-und Kleinschreibung Farbstoff und nicht im Vergleich Verschiebung erkannt behandelten Zellen mit Carboxy-H 2 DCFDA gebeizt). Die Ergebnisse bestätigen das Vorhandensein von ROS in den behandelten Zellen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3357/3357fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2: Nachweis of NO mit Griess-Reagenzien. RAW 264.7 Zellen (Maus-Makrophagen) wurden mit LPS und IL-4 behandelt. Ein signifikant erhöhtes in NO-Produktion wurde in den behandelten Zellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen steuern erkannt. <table border="1"><tbody><tr><td> Zell-Linien </td><td> Unbehandelte </td><td> Behandelte </td></tr><tr><td> RAW 264.7 </td><td> 13,0 </td><td> 8,3 </td></tr><tr><td> A549 </td><td> 21,6 </td><td> 10,5 </td></tr><tr><td> Jurkat </td><td> 5,2 </td><td> 2,8 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Nachweis von ROS vermittelten Oxidation von Proteinen. RAW 264.7 Zellen mit LPS, Jurkat und A549 behandelt wurden (menschlichen Lungenkrebs-Zellen) wurden mit H 2 O 2 behandelt. Die Ergebnisse werden ausgedrückt als das Verhältnis reduziert (GSH) / oxidiert (GSSG) Glutathion. Niedrigere Verhältnisse von Glutathion (GSH) / (GSSG) wurden in den behandelten Zellen im Vergleich zu erfassendeKontrolle unbehandelte Zellen und enthüllt, dass Proteine ​​mehr wurden in den behandelten Zellen oxidiert.

<ol><li>Guzik, T. J., Korbut, R., Adamek-Guzik, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+and+superoxide+in+inflammation+and+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation.</a> J Physiol Pharmacol. 54, 469-487 (2003).</li>
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<li>Nakamura, K., Yube, K., Miyatake, A., Cambier, J. C., Hirashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+CD4+D3-D4+membrane+proximal+extracellular+domain+for+the+inhibitory+effect+of+oxidative+stress+on+activation-induced+CD4+down-regulation+and+its+possible+role+for+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Involvement of CD4 D3-D4 membrane proximal extracellular domain for the inhibitory effect of oxidative stress on activation-induced CD4 down-regulation and its possible role for T cell activation.</a> Mol Immunol. 39, 909-921 (2003).</li>
<li>Los, M., Droge, W., Stricker, K., Baeuerle, P. A., Schulze-Osthoff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+as+a+potent+activator+of+T+lymphocyte+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide as a potent activator of T lymphocyte functions.</a> Eur J Immunol. 25, 159-165 (1995).</li>
<li>Deem, T. L., Cook-Mills, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+cell+adhesion+molecule+1+%28VCAM-1%29+activation+of+endothelial+cell+matrix+metalloproteinases%3A+role+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) activation of endothelial cell matrix metalloproteinases: role of reactive oxygen species.</a> Blood. 104, 2385-2393 (2004).</li>
<li>Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+and+peroxynitrite+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease.</a> Physiol Rev. 87, 315-424 (2007).</li>
<li>Griendling, K. K., Sorescu, D., Lassegue, B., Ushio-Fukai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+protein+kinase+activity+and+gene+expression+by+reactive+oxygen+species+and+their+role+in+vascular+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulation of protein kinase activity and gene expression by reactive oxygen species and their role in vascular physiology and pathophysiology.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 2175-2183 (2000).</li>
<li>Loh, K., Deng, H., Fukushima, A., Cai, X., Boivin, B., Galic, S., Bruce, C., Shields, B. J., Skiba, B., Ooms, L. M., Stepto, N., Wu, B., Mitchell, C. A., Tonks, N. K., Watt, M. J., Febbraio, M. A., Crack, P. J., Andrikopoulos, S., Tiganis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+enhance+insulin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species enhance insulin sensitivity.</a> Cell Metab. 10, 260-272 (2009).</li>
<li>Goldstein, B. J., Mahadev, K., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+paradox%3A+insulin+action+is+facilitated+by+insulin-stimulated+reactive+oxygen+species+with+multiple+potential+signaling+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Redox paradox: insulin action is facilitated by insulin-stimulated reactive oxygen species with multiple potential signaling targets.</a> Diabetes. 54, 311-321 (2005).</li>
</ol>

Wir erhielten Unterstützung von Promega für diese Veröffentlichung.

Mehrere pathologischen Situationen wie entzündlichen Erkrankungen, Krebs, Ischämie / Reperfusion und auch Behandlungen wie Bestrahlung oder Chemotherapie (dh Cisplatin) induzieren ROS Überproduktion. So erkennen und zu messen ROS Ebenen ist in vielen grundlegenden, präklinischen und klinischen Studien wichtig. Allerdings haben ROS sehr kurze Halbwertszeiten und könnte kompliziert zu erkennen. Hier schlagen wir vor, einfache Tests, die routinemäßig verwendet werden, und weithin akzeptierte für den Nachweis von Produktion...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> 5 - (und-6)-Carboxy-2 &#39;, 7&#39;-Dichloro-diacetat (Carboxy-DCFDA) </td><td> Molecular Probes </td><td> C369 </td><td> Steuerung </td></tr><tr><td> Carboxy-H 2 DCFDA </td><td> Molecular Probes </td><td> C400 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfanilamid </td><td> Sigma </td><td> S9251-100G </td><td></td></tr><tr><td> N-1-napthylethylenediamine dihydrochlorid </td><td> Sigma </td><td> N9125-10G </td><td></td></tr><tr><td> Nitrit-Standard </td><td> Sigma </td><td> 237213-100G </td><td></td></tr><tr><td> GSH / GSSG-Glo Assay </td><td> Promega </td><td> V6612 </td><td> Um oxidiert, reduziert quantifizieren oder oxidierten / reduzierten Glutathion </td></tr></tbody>
</table>

produktion und nachweis von reaktiven sauerstoffspezies (ros) in cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Reaktive Sauerstoffspezies sind eine Reihe von Molekülen, die Schäden von DNA und RNA und oxidieren Proteine ​​und Lipide (Lipid peroxydation). Diese reaktiven Moleküle enthalten eine Sauerstoff und sind H 2 O 2 (Wasserstoffperoxid), NO (Stickstoffmonoxid), O 2 - (Oxid-Anionen), Peroxynitrit (ONOO -), hydrochlorous Säure (HOCl) und Hydroxyl-Radikal (OH -) . Oxidativer Arten sind nicht nur unter pathologischen Situationen (Krebs, ischämischer / Reperfusion, neurologischen und Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Infektionskrankheiten, Entzündungskrankheiten 1, Autoimmunerkrankungen 2, etc ...), sondern auch während der physiologische (nicht krankhafte) Situationen wie Zellstoffwechsel 3 hergestellt , 4. In der Tat spielen ROS eine wichtige Rolle in vielen zellulären Signalwege (Proliferation, Zell-Aktivierung 5, 6, 7 etc. Migration.). ROS können schädlich sein (es wird dann bezeichnet als&quot;Oxidativen Stress und nitrosative&quot;), wenn in großen Mengen in den intrazellulären Kompartimenten und Zellen produziert allgemein ROS reagieren heraufregulierende Antioxidantien wie Superoxid-Dismutase (SOD) und Katalase (CAT), Glutathionperoxidase (GPx) und Glutathion (GSH), das schützt sie durch die Umwandlung gefährlichen freien Radikale in unschädliche Moleküle (zB Wasser). Vitamine C und E sind auch als ROS-Fänger (Antioxidantien) beschrieben worden. Freie Radikale sind vorteilhaft in niedrigen beträgt 3. Makrophagen und neutrophilen Granulozyten-vermittelte Immunantwort beinhalten die Produktion und Freisetzung von NO, die Viren, Krankheitserreger und Tumorproliferation 8 hemmt. NO reagiert auch mit anderen ROS und somit hat auch eine Rolle als detoxifier (ROS Scavenger). Schließlich NO wirkt auf Schiffen, um den Blutfluss, die wichtig für die Anpassung der Muskel längere Übung 9, 10 zu regulieren. Mehrere Veröffentlichungen haben auch gezeigt, dass ROS in Insulin-sens beteiligt sinditivity 11, 12. Zahlreiche Methoden zur ROS-Produktion zu bewerten sind. In diesem Artikel schlagen wir mehrere einfache, schnelle und kostengünstige Assays; diese Tests wurden von zahlreichen Publikationen validiert und werden routinemäßig verwendet werden, um ROS oder ihre Auswirkungen in Säugetierzellen zu erkennen. Während einige dieser Tests mehrere ROS erkennen, erkennen andere nur ein einziges ROS.

Hier schlagen wir einfache Methoden zu testen und auszuwerten Anwesenheit von reaktiven Sauerstoffspezies in den Zellen.

Produktion und Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Cancers

Reaktive Sauerstoffspezies umfassen eine Reihe von Molekülen, die DNA und RNA schädigen sowie Proteine und Lipide oxidieren (Lipidperoxidation). Diese reaktiven ...

Das Ziel dieses Experiments besteht darin, das Vorhandensein reaktiver Sauerstoffspezies in Zellkulturen nachzuweisen. Dies wird zunächst durch den Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies mit einem fluoreszierenden Farbstoff erreicht. Anschließend werden die Konzentrationen von Stickstoffmonoxid in den Zellen mittels einer farbmetrischen Analyse gemessen.Schließlich wird der Effekt reaktiver Sauerstoffspezies bestimmt, indem die Reduktion oder Oxidation von Glutathion mithilfe eines lumineszenten Assays nachgewiesen wird. Mein Name ist Danu. Ich bin ein Poster im Labor von Patrizia Yoda, und ich werde dieses Verfahren demonstrieren.Carboxy H2DCFDA ist nicht fluoreszierend, aber in Gegenwart von reaktiven Sauerstoffspezies wird dieses Reagenz oxidiert und fluoresziert unmittelbar vor der Verwendung grün. Bereiten Sie eine frische Stammlösung von Carboxy H2DCFDA in sterilem DMSO oder 100 %igem Ethanol zu. Waschen Sie die Zellen mit HEPES-pufferter Salzlösung oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung, um Rückstände des ursprünglichen Mediums zu entfernen.Bei diesem Assay verwenden wir die humane Leukämie-Jerk-Cat-Zelllinie. Nach dem Zentrifugieren verwerfen Sie das Überstand-Medium und bel

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Video beschreibt das Protokoll zum Nachweis der gesamten zellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung von 2',7'-Dichlordidihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA). Diese Methode hilft dabei, die ROS-Lokalisierung in den adhärenten Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop zu visualisieren und die ROS-Intensität mit einem Fluoreszenzplatten-Reader weiter zu quantifizieren.

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Intrazellulären ROS hat nachweislich eine wichtige Rolle in der Induktion der zellulären Seneszenz. Hier beschreiben wir einen sensible Assay zur Quantifizierung der ROS Ebenen während der zellulären Seneszenz. Wir bieten auch Protokolle für die Beurteilung des Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyps, was angeblich zu verschiedenen altersbedingte Funktionsstörungen beiträgt.

Eine Quantitative Messung von reaktiven Sauerstoffspezies und Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp in normalen menschlichen Fibroblasten während Onkogen-induzierte Seneszenz

Wir beschreiben eine nicht-invasive in Vivo imaging-Protokoll, das schlanke und kostengünstige, Verwendung von L-012, eine Chemolumineszenz Luminol-Analog, zu visualisieren und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erzielte eine excisional Wunde Mausmodell zu quantifizieren.

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Diese Studie zeigt den Einsatz der Durchflusszytometrie, reaktive Sauerstoff Spezies (ROS) Produktion durch Aktivierung der FcγR zu erkennen. Diese Methode kann verwendet werden, Änderungen in der antimikrobiellen und Redox signaling Funktion der Phagozyten in Reaktion auf Immunkomplexe, opsonized Mikroorganismen oder direkte FcγR Vernetzung zu beurteilen.

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Wir beschreiben eine Methode zur Verwendung von Multiparameter-Durchflusszytometrie zum Nachweis von mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in murinen gesunden hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und Leukämiezellen aus einem Mausmodell akuter myeloischer Leukämie (AML), das von MLL-AF9.

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis der gesamten ulzellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) mit 2',7'--Dichlordihydrofluorescein-Diaacetat (DCFH-DA) vor. Diese Methode kann die zelluläre ROS-Lokalisierung in anhaftenden Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop visualisieren und die ROS-Intensität mit einem Fluoreszenzplattenleser quantifizieren. Dieses Protokoll ist einfach, effizient und kostengünstig.

Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies insgesamt in anhaftenden Zellen durch 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetat-Färbung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die vorübergehende In-vivo-Produktion von nicht-letalen Mengen an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in der Haut von Mäusen zu induzieren und so die physiologischen Reaktionen im Gewebe weiter zu fördern.

Stimulation von Stammzellnischen und Geweberegeneration in der Haut von Mäusen durch schaltbare Protoporphyrin IX-abhängige Photogeneration reaktiver Sauerstoffspezies in situ

Hier schlagen wir ein systematisiertes, zugängliches und reproduzierbares Protokoll vor, um zelluläre reaktive Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung einer 2′,7′-Dichlorfluorescein-Diacetatsonde (DCFH-DA) in Müller-Gliazellen (MGCs) nachzuweisen. Diese Methode quantifiziert die gesamten zellulären ROS-Spiegel mit einem Durchflusszytometer. Dieses Protokoll ist sehr einfach zu bedienen, geeignet und reproduzierbar.

Quantifizierung reaktiver Sauerstoffspezies mittels 2′,7′-Dichlorfluorescein-Diacetatsonde und Durchflusszytometrie in Müller-Gliazellen

Hier beschreiben wir eine Methode zur Echtzeit-Detektion der Produktion von apoplastischen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Reisgeweben in einer pathogen-assoziierten molekularmuster-ausgelösten Immunantwort. Diese Methode ist einfach, standardisiert und erzeugt unter kontrollierten Bedingungen hochreproduzierbare Ergebnisse.

Echtzeit-Detektion der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies bei der Immunantwort in Reis mit einem Chemilumineszenz-Assay

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Methode zur Quantifizierung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung von Dihydroethidium (DHE) als Fluoreszenzfarbstoffsonde unter Verwendung eines Hochdurchsatz-Screening-Ansatzes. Das Protokoll beschreibt die Methoden zur quantitativen Beurteilung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in den drei verschiedenen hepatozellulären Karzinomzelllinien.

Hochdurchsatz-Screening-Bewertung der Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) mit Dihydroethidium (DHE)-Fluoreszenzfarbstoff

Lernen Sie die Detektion reaktiver Sauerstoffspezies in Zellkulturen mit fluoreszierenden Farbstoffen und lumineszenten Assays. Diese Methoden ermöglichen die Bewertung oxidativen Stresses und zellulärer Redox-Zustände.

Produktion und Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Cancers

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