Directed Cellular Self-Assembly to Cell-Derived Tissue Ringe für biomechanische Analyse und Tissue Engineering Fabricate

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, 3D-Gewebekonstrukte aus aggregierten Zellen und zellabgeleiteter Matrix zu erstellen, die für die Funktionsanalyse verwendet werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Polycarbonatform gefräst wird, um ringförmige Vertiefungen mit rundem Boden zu erzeugen. Als nächstes wird Polydimethylsloane oder PDMS auf die Polycarbonatform gegossen, um eine Schablone zu erstellen.

Dann wird die PDMS-Vorlage verwendet, um Arous-Wells zu bilden. Der letzte Schritt besteht darin, die Zellen in Arous-Vertiefungen zu säen, damit sie sich zusammenballen und zusammenhängende Geweberinge bilden können. Letztendlich kann diese Methode verwendet werden, um zelluläre Selbstorganisation und Tissue Engineering unter Verwendung verschiedener Zelltypen zu erreichen, und ermöglicht die Analyse des Beitrags von Zellen und zellabgeleiteter extrazellulärer Matrix zur Gewebestruktur und -funktion.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Tissue-Engineering-Ansätzen besteht darin, dass wir Gewebekonstrukte vollständig aus Zellen und der extrazellulären Matrix erzeugen können, die sie schneller produzieren als bisher berichtet, und zwar in einem Format, das für die mechanische Analyse förderlich ist. Beginnen Sie mit dem Fräsen eines halben Zoll dicken Stücks Polycarbonat, um 15 ringförmige Vertiefungen mit rundem Boden und einem Durchmesser des Mittelpfostens von zwei Millimetern zu erzeugen. Reinigen Sie die Polycarbonatform, um alle Kunststoffreste zu entfernen, die beim Mahlprozess entstanden sind, und lassen Sie die Form trocknen. Mischen Sie anschließend PDMS in einem Verhältnis von 10 zu eins: Entgasen Sie die Lösung, um alle Luftblasen zu entfernen, und gießen Sie sie dann in die Polycarbonatform.

Entgasen Sie dann die Mischung erneut in der Form, um alle verbleibenden Luftblasen zu entfernen, und härten Sie das PDMS in einem Ofen bei 60 Grad Celsius für vier Stunden aus, während das PDMS aushärtet, lösen Sie es auf. 2%AROS in DMEM Entfernen Sie nach dem Aushärten vorsichtig die PDMS-Vorlage, indem Sie sie langsam vom Polycarbonat abziehen, waschen Sie dann das PDMS mit Wasser und Seife und autoklavieren Sie es zusammen mit der DMEM AROS-Lösung. Platzieren Sie nun die PDMS-Schablone des Autoklaven auf einer ebenen Fläche und füllen Sie sie mit geschmolzenem Aros, indem Sie zuerst Arous in jede der Mittelpfostenformen pipettieren und dann Arous in den Raum um sie herum pipettieren.

Lassen Sie die Aros ca. 15 Minuten lang festigen. Drehen Sie dann die Form um, um die Aros aus dem PDMS zu lösen. Schneiden Sie die überschüssigen Aros um jede Vertiefung herum ab und legen Sie dann eine Aros Vertiefung in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte. Jetzt.

Geben Sie Zellkulturmedien um die Außenseite der Aros-Vertiefung, ohne die Oberseite der Vertiefung abzudecken. Legen Sie dann die Platten in den Inkubator, damit sie sich äquilibrieren können, während die Zellen vorbereitet werden. Bei 90% Konfluenz Trypsin, glatte Muskelzellen der Rattenaorta und Reanimation.

Suspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von fünf mal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter. Pipettieren Sie dann 100 Mikroliter der resuspendierten Zellsuspension in jede der äquilibrierten Aros-Vertiefungen. Wenden Sie eine kreisende Bewegung an, um die Zellen auf jede der Vertiefungen aufzutragen.

Legen Sie die Platten in den Inkubator, um sie 24 Stunden lang ungestört zu sitzen. Tauschen Sie das Medium alle zwei Tage aus, indem Sie das Medium um die Vertiefung herum ansaugen und dann jede Vertiefung neu füllen, bis die Aros-Form vollständig untergetaucht ist. Und am Ende der Kultur füllen Sie eine kleine Petrischale mit PBS.

Nehmen Sie jeden Ring aus seiner Aros-Form, indem Sie ihn über die Oberseite des Mittelpfostens schieben. Platzieren Sie die Ringe in den Petrischalen mit PBS Center, einem Ring unter dem digitalen Bildgebungssystem. Verwenden Sie eine Kantenerkennungssoftware, um die Dicke des Rings in vier Positionen zu messen: oben, unten, links und rechts um seinen Umfang.

Zur Durchführung von einachsigen Zugversuchen. Montieren Sie eine Ringprobe auf zwei dünne Drahtgriffe. Verlängern Sie die Griffe, bis eine Reißlast von fünf Milli Newton auf den Ring ausgeübt wird.

Geben Sie dann die aus den Dickenmessungen berechnete Querschnittsfläche ein und erfassen Sie die Messlänge. Den Ring zwischen der Aufreißlast und 50 Kilopascal achtmal vorzyklieren. Stress mit einer Rate von 10 Millimetern pro Minute nach dem achten Vorzyklus zog sich bei 10 Millimetern pro Minute zum Versagen.

Messen Sie für jeden Ring die Zugspannung und die Versagensdehnung und berechnen Sie den maximalen Tangentenmodul aus den erfassten Daten. Neben funktionellen in vitro-Studien können diese lebenden Zellringe auch zu Geweberöhrchen verschmelzen. Schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere die Enden der Silikonschläuche schräg ab, um abgeschrägte Kanten zu erzeugen, und autoklavieren Sie dann die Silikonschläuche, während die Schläuche autoklaviert werden.

Füllen Sie eine Petrischale mit medienübertragenden, sterilisierten, kundenspezifischen Silikonröhrchenhaltern in eine Biosicherheitswerkbank und legen Sie sie in eine leere Petrischale. Entfernen Sie dann die Ringe aus den Aros-Vertiefungen und legen Sie sie in die mit Medien gefüllte Petrischale. Legen Sie die Silikonschläuche in dieselbe Petrischale, um sie vor dem Gebrauch zu befeuchten.

Platzieren Sie mit einer Pinzette die Spitze eines Silikonschlauchs in der Mitte eines Rings und schieben Sie den Ring vorsichtig auf den Silikonschlauch. Schieben Sie die Ringe in Kontakt miteinander, indem Sie sie vorsichtig nacheinander in beide Richtungen entlang des Rohrs schieben. Sobald die Ringe montiert sind, richten Sie die Silikonschläuche in den Polycarbonat-Halterungen aus und verschrauben Sie die beiden Teile der Halterung miteinander.

Geben Sie 55 Milliliter Medium in die Petrischale. Tauschen Sie das Medium für die Dauer der Kultur alle drei Tage aus, um die Geweberöhrchen zu entfernen. Füllen Sie zunächst eine Petrischale mit PBS.

Lösen Sie dann die Silikonschläuche aus dem Polycarbonat-Halter und schieben Sie die Gewebeschläuche mit einer Pinzette vom Silikonschlauch in die Schale. Bei korrekter Durchführung setzen sich die Zellen am Boden der Arros-Vertiefungen ab und ziehen sich innerhalb von 24 Stunden nach dem Sitzen zusammen, um einen Gewebering um den Mittelpfosten in der Agarros-Vertiefung zu erzeugen. Dies ist ein repräsentatives Diagramm einer Spannungs-Dehnungs-Kurve, die aus einem einachsigen Zugversuch eines zwei Millimeter großen Geweberings gewonnen wurde, der aus glatten Muskelzellen der Ratte erzeugt wurde. Die Zugfestigkeit, der maximale Zugmodul und die Versagensdehnungswerte werden dann verwendet, um die mechanischen Eigenschaften von Geweberingproben zu vergleichen, die unter verschiedenen Kulturparametern gezüchtet wurden.

Die mechanischen Eigenschaften von Geweberingen können durch Ändern von Kulturparametern gesteuert werden, einschließlich der Anzahl der Zellsitzplätze, der Länge der Kultur, des Kulturmediums und des verwendeten Zelltyps. Zusätzlich zu den glatten Muskelzellen der Ratte. Menschliche primäre, glatte Muskelzellen bilden Geweberinge mit ähnlicher Zugfestigkeit.

Menschliche mesenchymale Stammzellen aggregieren sich ebenfalls zu Ringen, aber sie waren nicht stark genug für mechanische Tests. Unser System ermöglicht die Herstellung von künstlich hergestellten Gewebekonstrukten, die vollständig aus Zellen bestehen, indem Zellen einfach in unsere kundenspezifischen Arous-Wells ausgesät werden. Sobald die erste Polycarbonat-Form bearbeitet wurde, können wir eine unbegrenzte Anzahl von PDMS-Schablonen herstellen, die dann zur Herstellung der Formen verwendet werden können, so dass keine zusätzliche Ausrüstung erforderlich ist.

Das System ist insofern vielseitig, als wir eine Reihe verschiedener Zelltypen in dem System verwendet haben, um Geweberinge herzustellen, und so könnte dieses System potenziell sowohl für Tissue-Engineering-Anwendungen als auch für In-vitro-Studien über den Beitrag von Zellen und extrazellulärer Matrix zur Gewebestruktur und -funktion eingesetzt werden.