Name: Directed Cellular Self-Assembly to Cell-Derived Tissue Ringe für biomechanische Analyse und Tissue Engineering Fabricate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Erfahren Sie die gerichtete zelluläre Selbstassemblierung zur Herstellung von Gewebesegmenten für biomechanische Analysen. Diese Methode nutzt glatte Muskelzellen in Agarose-Vertiefungen für Tissue-Engineering-Anwendungen.

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Die Autoren danken Neil Whitehouse (WPI, Higgins Machine Shop) für seine Hilfe bei der CNC-Bearbeitung. Darüber hinaus möchten wir Adriana Hera (WPI Computing and Communications Center) für ihre Hilfe bei MATLAB-Programmierung, sowie Kate Beverage und Joseph Cotnoir (WPI Academic Technology Center) danken für die Unterstützung bei Camtasia. Sophie Burke und Jacleen Becker (WPI Academic Technology Center) vorgesehen zusätzliche Videomaterial. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (R15 HL097332), die UMass Medical School-WPI Pilot Research Initiative, die American Heart Association (undergraduate Forschungsstipendium an JZH) und Worcester Polytechnic Institute (Summer Undergraduate Research Fellowship an JZH und institutionelle finanziert Anschubfinanzierung für MWR).

1. Zellaussaat Formenbau Beginnen Sie mit dem Fräsen einer 1 / 2 "dickes Stück aus Polycarbonat bis 15, mit rundem Boden, ringförmigen Vertiefungen mit einer Mittelsäule Durchmesser von 2 mm zu schaffen. Die gefrästen Kanäle sind 6 mm tief und 3,75 mm breit. Reinigen und trocknen Sie das Polycarbonat Schimmel entfernen Sie alle Kunststoff-Ablagerungen aus dem Mahlvorgang. Mix Polydimethylsiloxan (PDMS) bei einem Verhältnis von 10:1 (w / w) von Base zu Härter, Degas, um alle Luftblasen zu entfernen, und gießen Sie auf das Polycarbonat Form. Degas wieder entfernen Sie alle verbleibenden Blasen und Heilung in den Ofen bei 60 ° C für 4 Stunden. Einmal ausgehärtet, entfernen Sie vorsichtig die PDMS-Vorlage durch langsames Abziehen es weg von der Polycarbonat, mit Wasser und Seife waschen, und Autoklaven. Auch Autoklaven eine Lösung von zwei Prozent Agarose (w / v) gelöst in Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM). Legen Sie die PDMS-Vorlage auf eine ebene Fläche und füllen mit geschmolzenem aga stieg um ersten Pipettierung Agarose in jedem der Mitte nach Schimmel, und dann Pipettieren in den Raum um ihn herum. Lassen Sie die Agarose sich verfestigen (ca. 15 Minuten), dann invertieren die Form der Agarose aus dem PDMS freizugeben. Cut über Agarose aus der ganzen jede der Vertiefungen und legen Sie die Agarose Bohrungen in 12-Well-Platten. 2. Zellkultur-und Ring-Aussaat Add Zellkulturmedien (DMEM mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin) um die Außenseite der Agarose Form, ohne die Oberseite der Formen. Legen Sie die Platten in den Inkubator und es ihnen ermöglichen, für ca. 15 Minuten ausgleichen, während Sie die Zellen herzustellen. Bei 90% Konfluenz trypsinize Rattenaorta glatten Muskelzellen (rSMCs) und resuspendieren in einer Konzentration von 5x10 6 Zellen / ml. Je 100 ul Zellsuspension in jede der ringförmigen Agarose Brunnen, mit kreisenden Bewegungen, um Zellen in jede Vertiefung gelten. content "&gt; Stellen Sie sicher, Inkubator Regale sind Ebene, dann die Platten in den Inkubator und ihnen erlauben, sitzen 24 Stunden lang ungestört. Exchange Medium alle zwei Tage danach durch Ansaugen der Medien aus der ganzen gut, und re-Füllung in jede Vertiefung, bis die Agarose gut ist völlig untergetaucht. 3. Tissue Ring Ernte-und Dickenmessung Am Ende der Kultur, entfernen Sie den Ring aus der Agarose Form, indem Sie ihn über den Rand des Zentrums zu posten. Legen Sie den Ring in einer kleinen Petrischale mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), in der Mitte der Probe, und erwerben Sie ein Bild mit einer digitalen Imaging-System. Verwenden Sie eine Bildanalyse-Programm für die Kantenerkennung und messen die Dicke des Rings in 4 Positionen (oben, unten, links und rechts) um seinen Umfang. Berechnen Sie die mittlere Dicke Wert (t) für jeden einzelnen Ring, und verwenden Sie diesen Wert auf die Querschnittsfläche berechnen(2π (t / 2) 2). 4. Mechanische Prüfung von Ringen Richten Sie die Zugprüfmaschine (Instron EPS 1000) in die horizontale Position. Bringen Sie eine 1N ± 1mN Wägezelle und benutzerdefinierte dünnen Draht Griffe (erstellt durch Biegen Edelstahlseile). Montieren Sie den Ring Probe auf den beiden dünnen Draht Griffe. Verlängern Sie die Griffe bis zu einem 5 mN Taralast auf die Probe aufgebracht wird. Geben Sie die Querschnittsfläche (berechnet aus Dickenmessungen) und notieren Sie die Messlänge. Pre-Zyklus der Ringe 8-mal zwischen den Taralast und 50 kPa Stress mit einer Geschwindigkeit von 10 mm / min. Nach dem achten pre-Zyklus, zum Scheitern zu ziehen bei 10 mm / min. Das Scheitern ist eine Abnahme der Kraft um 40% von einer Messung zur nächsten vermerkt. Für jeden Ring Probe messen die Zugfestigkeit (UTS) und Bruchdehnung und berechnen Sie den maximalen Tangente Modul (MTM) aus den gewonnenen Daten. 5. Tissue-Ring alssammlung zu fertigen Gewebe Rohre Benutzerdefinierte Rohrhalter aus Runde 5 cm Polycarbonat Scheiben mit rechteckigen Aussparungen (2 cm x 3 cm) bearbeitet. Drill Gewindebohrungen durch diese Scheiben zu ermöglichen zwei Halterungen miteinander verschraubt werden. Autoclave die benutzerdefinierte Gefäßhalter und dann Transfer zum Biosicherheitswerkbank und in eine leere Petrischale. Verwenden chirurgische Schere an den Enden von 1,9 mm Durchmesser Silikonschläuche in einem Winkel zur abgeschrägten Kanten zu schaffen geschnitten und anschließend autoklavieren Silikonschläuche. Während die Rohre sind autoklaviert wird, füllen eine Petrischale mit Medien. Entfernen Sie die Ringe von der Agarose Brunnen und legen Sie sie in der Petrischale mit den Medien. Ort autoklaviert Silikonschläuche in der gleichen Petrischale, um sie vor dem Gebrauch nass. Verwenden einer Pinzette, um eine abgeschrägte Ende einer Silikon-Schlauch in der Mitte einen Ring Platz und schieben Sie den Ring auf den Silikonschlauch. Wiederholen Sie die gewünschte Anzahl von rings. Schieben Sie die Ringe in Kontakt miteinander, indem Sie ihn sie nacheinander in beiden Richtungen entlang der Röhre. Diese Methode kann für Ringe nach nur einem Tag in Kultur geerntet werden. Sobald Ringe befestigt sind, richten Sie Silikonschläuche in der Polycarbonat-Halterungen ein und die beiden Teile der Halterung zusammen. Setzen Sie den Halter in eine 100 mm Petrischale und fügen 55 mL Medien. Börse Medien alle 3 Tage für die Dauer der Kultur. Zum Entfernen des Gewebes Rohre, lassen Sie die Silikonschläuche aus dem Polycarbonat Halter und Pinzette verwenden, um das Gewebe Rohre aus dem Silikon-Schlauch und in eine Petrischale mit PBS gefüllte Rutsche. 6. Repräsentative Ergebnisse: Wenn das Protokoll korrekt durchgeführt wird, aggregierte Zellen, Gewebe-Ringe mit einem inneren Durchmesser gleich dem Durchmesser der entsprechenden Form post innerhalb von 24 Stunden zu bilden. Die Kanten des Rings sind in der Regel in Erscheinung glatt und (wenn cultured auf einer ebenen Fläche), sind in der Dicke um den gesamten Umfang einheitlich. Das Gewebe Ringe sind einfach zu handhaben und kann aus ihren Brunnen für nachfolgende mechanische und histologische Analyse (siehe in Gwyther et al., 2011 8) entfernt werden. Tissue Ring Morphologie, Matrix Zusammensetzung und mechanischen Eigenschaften variieren je nach Anzahl und Art der Zellen ausgesät. Repräsentative Ergebnisse aus Gewebe Ringe aus unterschiedlichen Zelltypen, Aussaat Bedingungen, und die Kultur der Länge hergestellt, sind in Tabelle 1 dargestellt. Zwei mm ID Ringe von 5x10 5 rSMCs erstellt zeigten eine höhere UTS als Ringe aus unserer bisher veröffentlichten 2 mm Ringe (aus 6.6x10 5 rSMCs) erstellt. 8 Ähnlich wie bei Ratten-Zellen, humanen glatten Muskelzellen (HSMC) leicht aggregiert, um Gewebe zu bilden Ringe, die eine große Menge von Kollagen nach nur 14 Tagen in Kultur (Daten nicht gezeigt) enthalten. Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) auch aggregiert und bilden geschlossene Ringe, sondern lacked mechanische Festigkeit und brach während der ersten precycling Phasen der einachsigen Zugversuch. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> n </td><td> Die Zellzahl </td><td> Dicke (mm) </td><td> Länge der Kultur (Tage) </td><td> UTS (kPa) </td><td> MTM (kPa) </td><td> Bruchdehnung (mm / mm) </td></tr><tr><td> rSMC Ringe </td><td> 6 </td><td> 660.000 </td><td> 0,94 ± 0,12 </td><td> 14 </td><td> 97 ± 30 </td><td> 497 ± 91 </td><td> 0,50 ± 0,08 </td></tr><tr><td> rSMC Ringe </td><td> 4 </td><td> 500.000 </td><td> 0,53 ± 0,02 </td><td> 7 </td><td> 113 ± 8 </td><td> 189 ± 15 </td><td> 0,88 ± 0,05 </td></tr><tr><td> HSMC Ringe </td><td> 3 </td><td> 750.000 </td><td> 0,51 ± 0,05 </td><td> 14 </td><td> 160 ± 30 </td><td> 270 ± 20 </td><td> 0,92 ± 0,08 </td></tr><tr><td> hMSC Ringe </td><td> 3 </td><td> 750.000 </td><td> 0,40 ± 0,07 </td><td> 14 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Tabelle zeigt die Kultur Parameter und mechanischen Eigenschaften von 2 mm Ringe aus unterschiedlichen Zelltypen, Aussaat-Konzentrationen und Kultur Dauer erzeugt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. (A) Schematische Darstellung des Gewebes Ring Generierung. (B) Custom Polycarbonat Form mit gefrästen ringförmigen Vertiefungen. Zentrale Poststelle Durchmesser 2 mm. (C) PDMS-Vorlage, nachdem sie weg war aus dem Polycarbonat Form geschält. (D) Aggregierte Gewebe Ring in einer Agarose-Form mit einer 2 mm post kultiviert. (E) Zwei mm Durchmesser Gewebe Ring in PBS. Maßstabsbalken = 6 mm (B, C) und 2 mm (D, E). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Representative Grundstück von Spannungs-Dehnungs-Kurve produced aus einachsigen Zugversuch.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Seit kurzem besteht ein verstärktes Interesse an zell-basierte oder &quot;Gerüst-less&quot; Tissue Engineering Methoden, um einige der Einschränkungen von Gerüst-basierte Tissue Engineering Ansätze Adresse. Da cell-derived Gewebe aus Zellen bestehen und die Matrix die sie produzieren, sie von Natur aus enthalten viel höheren Zelldichten, enthalten keine körperfremden Materialien und kann vollständig aus menschlichen Zellen und Proteine ​​hergestellt werden. Gefäßprothesen aus menschlichen Zellen hergestellt werden erhebliche mechanische Festigkeit in Abwesenheit von exogenen Gerüsten (zB Berstdruck 3400 mmHg im Vergleich zu 1600 mmHg für den menschlichen Stammvenen) 12 zu erreichen. Obwohl zellbasierten Gefäßgewebe verbesserte Zelldichte und mechanischer Festigkeit, die meisten aktuellen Herstellungsverfahren (z. B. &quot;Blatt-based engineering&quot; 3,4,12 oder &quot;bioprinting&quot; 5,13) weisen erfordern umfangreiche Kultur Zeiträume (&gt; 3 Monate) oder Spezialausrüstung für 3D-Gewebe Konstruktion. Die cell-derived Gewebe Ring method hier beschriebenen ermöglicht eine schnelle zelluläre self-assembly, robuste 3D-Gewebe-Konstrukte in kurzer Zeit und ohne den Einsatz von Spezialgeräten zu bilden. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren, das wir entwickelt, um 2 mm Innendurchmesser Ratte glatten Muskulatur cell-derived Gewebe Ringe zu erstellen. Im vorliegenden Beispiel wurden Gewebeproben Ringe für 7 Tage (dann weitere 7 Tage zur Anellierung und tube formation kultiviert) kultiviert. Allerdings, 2 mm Ratte (und menschliche) glatten Muskelzellen Ringe können aus den Vertiefungen entfernt werden und sind kohäsive genug für das Handling (zB Übertragung auf Silikonschläuche) bereits einen Tag nach Zellaussaat. Darüber hinaus kann robuste Gewebe Ringe mit unterschiedlichen Innendurchmessern (2, 4 und 6 mm) mit dieser Methode durch einfache Änderung der post Durchmesser des ursprünglichen Polycarbonat Form erstellt werden. 8 Wir haben kürzlich auch die Polycarbonat-Formenbau modifiziert, um fünf 2 ermöglichen mm Aussaat Brunnen in einem einzigen Multi-Well-Agarose Kammer gegossen werden, dieverbraucht weniger PDMS und Agarose, und passt in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte (Daten nicht gezeigt). Änderungen in der post Durchmesser, die Breite der Aussaat gut, der Radius der Krümmung der abgerundeten Boden, kann die Anzahl der Aussaat Brunnen, oder die Tiefe der Aussaat Brunnen alle einfach durch Änderung der Angaben in der CAD-Datei für CNC geändert werden Bearbeitung der Polycarbonat-Form. Schließlich kann ein einziger Polycarbonat Form verwendet werden, um eine unbegrenzte Anzahl von PDMS-Vorlagen herzustellen, und jede PDMS Vorlage gereinigt werden kann, autoklaviert und wieder dutzende Male. Neben der Änderung der Größe des Gewebes Ringe haben wir Ringe aus vielen verschiedenen Zelltypen hergestellt, unter anderem: primären Ratten SMCs (Cell Applications, R354-05), primären humanen koronaren glatten Muskelzellen (Lonza, CC-2583), primäre humane Hautfibroblasten 11 (großzügige Schenkung von Dr. George Pins, WPI Abteilung für Biomedizinische Technik), Rattenlunge Fibroblasten (RFL-6, ATCC CCL-192) und mesenchymalen Stammzellen (Lonza, PT-2501). Jeder dieser Zelltypen Aggregate und Verträge rund um das Zentrum Beiträge von Gewebe Ringe bilden, obwohl die zelluläre Organisation, ECM Zusammensetzung und mechanischen Eigenschaften der Konstrukte variieren je nach Zelltyp. Die Aussaat Parameter für jeden Zelltyp muss empirisch auf der Grundlage der Größe der Zellen und ihre Fähigkeit zur Aggregation ermittelt werden. Während also dieses System zu schaffen, cell-derived Gewebe Ringe ist äußerst vielseitig, so kann das Protokoll müssen geringfügige Anpassungen für eine optimale Gewebsbildung mit verschiedenen Zelltypen. Tissue Ringgeometrie erleichtert das Be-und Beurteilung von Gewebe Materialeigenschaften von einachsigen Zugversuch, wie beschrieben. Es gibt auch erhebliche Präzedenzfall für die Nutzung der Blutgefäße Ringsegmente zu Gefäßkontraktion und physiologische Funktion zu messen. Vorläufige Studien deuten darauf hin, dass cell-derived Gewebe Ringe auf einem Draht Myographions Gerät zur Messung der pharmakologischen Ansprechbarkeit montiert werden undKontraktionskraft Generation (Daten nicht gezeigt). Insgesamt deutet die Fähigkeit, schnell herzustellen self-assembled Zelle Ringe für die histologische, mechanische, physiologische und biochemische Analyse ein leistungsfähiges neues Werkzeug, die nützlich sein für die Modellierung Gefäßgewebe Struktur und Funktion in Gesundheit und Krankheit.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes / Ausrüstung </th><th> Firma </th><th> Catalog # </th></tr><tr><td> Polydimethylsiloxan (PDMS) </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Lonza </td><td> 50000 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 15 bis 017-CV </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum (FBS) </td><td> PAA </td><td> A05-201 </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Mediatech </td><td> 30 bis 002-CI </td></tr><tr><td> Digital Imaging-System </td><td> DVT Corporation </td><td> Modell 630 </td></tr><tr><td> Einachsige Prüfmaschine </td><td> Instron </td><td> ElectroPuls E1000 </td></tr><tr><td> Edge Detection Software </td><td> DVT Corporation </td><td> Rahmenprogramm 2.4.6 </td></tr></tbody></table>

directed cellular self-assembly to cell-derived tissue ringe für biomechanische analyse und tissue engineering fabricate

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Jedes Jahr unterziehen sich Hunderttausende von Patienten einer koronaren Bypass-Operation in den Vereinigten Staaten. 1 Etwa ein Drittel dieser Patienten haben keine geeignete autologe Spender Schiffe wegen Fortschreiten der Erkrankung oder frühere Ernte. Das Ziel der vaskulären Tissue Engineering ist es, eine geeignete Alternative Quelle für diese Bypass-Transplantate entwickeln. Darüber hinaus kann technisch Gefäßgewebe als wertvoll erweisen als lebende vaskulären Modelle auf Herz-Kreislauf Erkrankungen zu studieren. Mehrere viel versprechende Ansätze zur technischen Blutgefäßen erforscht worden sind, mit vielen neueren Studien mit Schwerpunkt auf der Entwicklung und Analyse von Zell-basierten Methoden. 2-5 Hier stellen wir eine Methode, um schnell selbst montieren Zellen in 3D-Gewebe Ringe, die in verwendet werden können vitro zu modellieren Gefäßgewebe. Um dies zu tun, sind Suspensionen von glatten Muskelzellen in Rundkolben ringförmigen Agarose Brunnen ausgesät. Die nicht-klebenden Eigenschaften der Agarose erlauben the-Zellen zu regeln, zu aggregieren und Vertrag um einen Stab in der Mitte des Brunnens zu einer zusammenhängenden Gewebe Ring bilden. 6,7 Diese Ringe können über mehrere Tage vor der Ernte für mechanische, physiologische, biochemische oder histologische Analyse kultiviert werden. Wir haben gezeigt, dass diese Zellen abgeleiteten Gewebe Ringe bei 100-500 kPa Zugfestigkeit 8, die den Wert für andere Gewebezüchtung vaskulären Konstrukte für ähnliche Laufzeiten (&lt;30 kPa) kultiviert berichtet übersteigt Ertrag. 9,10 Unsere Ergebnisse zeigen, dass stabile Zelle -derived Gefäßgewebe Ring Generation kann innerhalb kurzer Zeit erreicht werden kann, und bietet die Möglichkeit für direkte und quantitative Bewertung der Beiträge der Zellen und Zell-abgeleitete Matrix (CDM) zu Gefäßgewebe Struktur und Funktion.

Dieser Artikel beschreibt eine vielseitige Methode zur cell-derived Gewebe Ringe durch zelluläre self-assembly erstellen. Glatte Muskelzellen in ringförmige Agarose Brunnen sammeln und Vertrag robust dreidimensionale (3D-) Gewebe innerhalb von 7 Tagen bilden ausgesät. Millimeter-Skala Gewebe Ringe sind förderlich für die mechanische Prüfung und dienen als Bausteine ​​für Gewebe Montage.

Directed Cellular Self-Assembly to Cell-Derived Tissue Ringe für biomechanische Analyse und Tissue Engineering Fabricate

Jedes Jahr unterziehen sich in den Vereinigten Staaten Hunderttausende von Patienten einer Koronararterien-Bypass-Operation.1 Etwa ein Drittel dieser Patienten erleidet ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, dreidimensionale Gewebekonstrukte aus aggregierten Zellen und zellulärer Matrix zu erzeugen, die für die funktionelle Analyse verwendet werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Polycarbonatform bearbeitet wird, um runde, ringförmige Vertiefungen herzustellen. Anschließend wird Polydimethylsiloxan oder PDMS auf die Polycarbonatform gegossen, um eine Vorlage zu erzeugen.Dann wird die PDMS-Vorlage verwendet, um aros-Vertiefungen zu formen. Im letzten Schritt werden Zellen in die aros-Vertiefungen geimpft, um deren Aggregation und die Bildung kohäsiver Geweberinge zu ermöglichen. Letztendlich kann diese Methode genutzt werden, um die zelluläre Selbstorganisation und Gewebeengineering unter Verwendung verschiedener Zelltypen zu erreichen und die Beiträge von Zellen sowie von zellulär abgeleiteter extrazellulärer Matrix zur Gewebestruktur und -funktion zu analysieren.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Ansätzen des Gewebescreenings besteht darin, dass wir Gewebekonstrukte vollständig aus Zellen und der von ihnen produzierten extrazellulären Matrix schneller erzeugen können als bisher berichtet, und zwar in einem Format, das für mechanische Analysen geeignet ist. Beginnen Sie damit, ein halb Zoll dickes Polycarbonatstück zu fräsen, um 15 runde, ringförmige Vertiefungen mit einem mittigen Zapfen von zwei Millimetern Durchmesser herzustellen. Reinigen Sie die Polycarbonatschablone, um Kunststoffrückstände, die beim Fräsen entstanden sind, zu entfernen, und lassen Sie die Schablone trocknen. Mischen Sie anschließend PDMS im Verhältnis 10 zu 1 (Basis zu Härter). Entgasen Sie die Lösung, um alle Luftblasen zu entfernen, und gießen Sie sie dann in die Polycarbonatschablone.Dann entgasen Sie die Mischung erneut an der Form, um verbleibende Luftblasen zu entfernen, und härten Sie das PDMS vier Stunden lang bei 60 Grad Celsius im Ofen aus, währenddessen das PDMS aushärtet. Lösen Sie 2 % AROS in DMEM. Nach der Aushärtung entfernen Sie die PDMS-Vorlage vorsichtig, indem Sie sie langsam von der Polycarbonatfläche ablösen, waschen Sie das PDMS mit Seife und Wasser und autoklavieren Sie es zusammen mit der DMEM-AROS-Lösung. Platzieren Sie nun die autoklavierte PDMS-Vorlage auf einer ebenen Fläche und füllen Sie sie mit geschmolzenem AROS, indem Sie zunächst AROS in jede der mittigen Stempelformen pipettieren und anschließend AROS in den Raum um diese herum pipettieren.Lassen Sie die Aros etwa 15 Minuten lang erstarren. Danach stülpen Sie die Form um, um die Aros vom PDMS zu lösen. Schneiden Sie die überschüssigen Aros um jede Vertiefung herum ab und platzieren Sie anschließend eine Aros-Vertiefung in jede Vertiefung einer 12-Loch-Platte. Jetzt.Geben Sie Zellkulturmedium um die Außenseite des Aros-Brunnens herum, ohne die Oberseite des Brunnens zu bedecken. Anschließend stellen Sie die Platten in den Inkubator, um sie zu equilibrieren, während die Zellen vorbereitet werden. Bei 90 % Konfluenz Trypsin, rat aortic smooth muscle cells und resus.Suspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von 5 × 10⁶ Zellen pro Milliliter. Pipettieren Sie anschließend 100 Mikroliter der resuspendierten Zellsuspension in jede der äquilibrierten Aros-Vertiefungen. Tragen Sie die Zellen unter Verwendung einer kreisförmigen Bewegung auf jede Vertiefung auf.Stellen Sie die Platten 24 Stunden lang ungestört in den Inkubator. Wechseln Sie das Medium alle zwei Tage, indem Sie das Medium um die Vertiefung herum abpipettieren und anschließend jede Vertiefung erneut auffüllen, bis die Aros-Form vollständig untergetaucht ist. Füllen Sie am Ende der Kultur eine kleine Petrischale mit PBS.Entfernen Sie jeden Ring von seiner Aros-Form, indem Sie ihn über die Spitze der Mittelsäule schieben. Legen Sie die Ringe in die Petrischalen mit PBS Center und platzieren Sie einen Ring unter dem digitalen Abbildungssystem. Verwenden Sie eine Kanten-Erkennungs-Software, um die Dicke des Rings an vier Positionen – oben, unten, links und rechts – entlang seines Umfangs zu messen.Zur Durchführung einer einachsigen Zugprüfung. Befestigen Sie eine Ringprobe an zwei dünnen Drahtklammern. Dehnen Sie die Klammern so lange aus, bis eine Zugkraft von fünf Millinewton auf den Ring ausgeübt wird.Geben Sie dann die aus den Dickenmessungen berechnete Querschnittsfläche ein und notieren Sie die Messlänge. Führen Sie acht Vorlastzyklen des Rings zwischen der Reißlast und 50 Kilopascal durch. Belasten Sie anschließend nach dem achten Vorlastzyklus mit einer Geschwindigkeit von 10 Millimetern pro Minute bis zum Bruch.Bestimmen Sie für jeden Ring die Bruchdehnung und die maximale Zugfestigkeit und berechnen Sie aus den gewonnenen Daten den maximalen Tangentenmodul. Neben funktionellen In-vitro-Studien können diese Zellringe auch zu Geweberöhren verschmelzen. Schneiden Sie die Enden der Silikonröhrchen mit einer chirurgischen Schere schräg ab, um abgeschrägte Kanten zu erzeugen, und autoklavieren Sie anschließend die Silikonröhrchen, während die Röhrchen autoklaviert werden.Füllen Sie eine Petrischale mit Medium, transferieren Sie sterilisierte, kundenspezifische Halter aus Silikonrohren in einen Biosicherheitsschrank und legen Sie sie in eine leere Petrischale. Entfernen Sie anschließend die Ringe aus den Aros-Vertiefungen und legen Sie sie in die mit Medium gefüllte Petrischale. Stellen Sie die Silikonrohre in dieselbe Petrischale, um sie vor der Verwendung anzufeuchten.Verwenden Sie eine Pinzette, um die Spitze eines Silikonschlauchs in die Mitte eines Rings zu platzieren, und schieben Sie den Ring vorsichtig auf den Silikonschlauch. Bringen Sie die Ringe durch vorsichtiges Verschieben in beide Richtungen entlang des Schlauchs nacheinander in Kontakt miteinander. Sobald die Ringe montiert sind, richten Sie die Silikonschläuche in den Polycarbonathaltern aus und schrauben die beiden Teile des Halters zusammen.Geben Sie 55 Milliliter Medium in die Petrischale. Wechseln Sie das Medium alle drei Tage während der gesamten Kultur, um die Gewebeschläuche zu entfernen. Füllen Sie zunächst eine Petrischale mit PBS.Danach lösen Sie die Silikonschläuche aus dem Polycarbonathalter und verwenden eine Pinzette, um die Geweberöhren vom Silikonschlauch abzuschieben und in die Schale zu überführen. Bei korrekter Durchführung setzen sich die Zellen in den Boden der Aros-Vertiefungen ab und ziehen sich innerhalb von 24 Stunden nach dem Einsetzen zusammen, um einen Gewebering um den Mittelpfosten in der Agarro-Vertiefung zu bilden. Dies ist eine repräsentative Darstellung einer Spannungs-Dehnungs-Kurve, die aus einem einaxialen Zugversuch an einem zwei Millimeter breiten Gewebering gewonnen wurde, der aus glatten Muskelzellen der Ratte generiert wurde. Die Zugfestigkeit, der maximale Zugmodul und die Bruchdehnung werden anschließend verwendet, um die mechanischen Eigenschaften von Geweberingen zu vergleichen, die unter verschiedenen Kulturbedingungen gezüchtet wurden.Die mechanischen Eigenschaften von Geweberingen können durch die Variation von Kulturbedingungen gesteuert werden, einschließlich der Zellansiedlungszahl, der Kulturdauer, des Kulturmediums und des verwendeten Zelltyps. Neben Ratten-Smooth-Muscle-Zellen bilden humane primäre Smooth-Muscle-Zellen Geweberinge mit ähnlicher Zugfestigkeit.Menschliche mesenchymale Stammzellen aggregieren ebenfalls zu Ringen, diese waren jedoch nicht stabil genug für mechanische Tests. Unser System ermöglicht die Herstellung von gewebetechnischen Konstrukten vollständig aus Zellen, indem Zellen einfach in unsere speziell angefertigten Aros-Vertiefungen gegeben werden. Sobald die ursprüngliche Polycarbonatform bearbeitet wurde, können wir eine unbegrenzte Anzahl an PDMS-Vorlagen herstellen, die anschließend zur Herstellung der Formen verwendet werden können, sodass keine zusätzliche Ausrüstung erforderlich ist.Das System ist vielseitig einsetzbar, da wir eine Reihe unterschiedlicher Zelltypen im System zur Herstellung von Geweberingen verwendet haben, und könnte daher potenziell sowohl für Anwendungen im Bereich des Gewebeengineerings als auch für In-vitro-Studien der Beiträge von Zellen und extrazellulärer Matrix zur Gewebestruktur und -funktion genutzt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Um hochorganisierte Strukturen aus komplexem Gewebe zu erzeugen, muss man mehrere Materialien und Zelltypen zu einem integrierten Komposit zusammenfügen.  Dieses kombinatorische Design umfasst organspezifische geschichtete Zellblätter mit zwei unterschiedlichen biologisch abgeleiteten Materialien, die eine starke fibröse Matrixbasis enthalten, und Endothelzellen zur Verbesserung der Bildung neuer Gefäße.

Tissue Engineering: Aufbau eines Multizelluläre 3D Gerüst für die Lieferung von Layered Zellschichten

In dieser Arbeit stellen wir eine Technik zur schnellen Herstellung von lebendem Gefäßgewebe durch direkte Kultivierung von Kollagen, glatten Muskelzellen und Endothelzellen vor. Darüber hinaus wird ein neues Protokoll zur mechanischen Charakterisierung von künstlich hergestellten Gefäßgeweben beschrieben.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Dieses Manuskript beschreibt die Erstellung von definiertem manipuliertem Herzgewebe unter Verwendung von Oberflächenmarker-Expression und Zellsortierung. Die definierten Gewebe können dann in einem Multigewebe-Bioreaktor verwendet werden, um Mechanismen der kardialen Zelltherapie zu untersuchen, um ein funktionsfähiges, aber dennoch kontrolliertes Modellsystem des menschlichen Herzens bereitzustellen.

Bau von Defined Menschen Engineered Herzgewebe zur Untersuchung Mechanismen der Herzzelltherapie

Dieses Protokoll beschreibt eine Bioprinting-Methodik, die ein automatisiertes robotergestütztes Abscheidesystem verwendet, das geätzte topographische Leitfäden mit der präzisen Abscheidung einer Zelle mit Hydrogel-Biotinte verbindet. Die gedruckten Zellen werden direkt auf die geätzten Merkmale aufgebracht und sind in der Lage, diese zu erfassen und sich daran zu orientieren.

Automatische Robotic Dosiertechnik für Oberflächen Ausrichtungs- und Bioprinting von Zellen

Skalierbare engineered Blutgefäße würde klinische Anwendbarkeit zu verbessern. Mit leicht ansehnliche 3D-gedruckte Führer, Ringe der glatten Gefäßmuskulatur wurden in eine röhrenförmige Form erstellt und gestapelt, ein Gefäßtransplantat zu bilden. Die Transplantate können so bemessen sein, um den Bereich der menschlichen Koronararterie Dimensionen gerecht zu werden, indem einfach die 3D-gedruckten Führungsgröße zu verändern.

Die Skalierung von Engineered Gefäßprothesen Mit 3D-gedruckte Führer und den Ring Stapelverfahren

Dieses Protokoll beschreibt eine Plattform für die Herstellung von selbst-zusammengebauten Gewebe Ringe in variablen Größen mit einer angepassten 3D-gedruckten Kunststoff-Formenbau. PDMS-negative sind in der Form 3D-gedruckten geheilt; dann wird Agarose in die ausgehärtete PDMS negative gegossen. Zellen sind in die resultierende Agarose-Brunnen gesät, wo sie ins Gewebe Ringe aggregieren.

Herstellung von benutzerdefinierten Agarose Brunnen für die Aussaat von Zelle und Gewebe Ring Selbstmontage mit 3D-Druck Formen

Hier präsentieren wir Ihnen eine schnelle, einfache und kostengünstige Methode zur Herstellung von benutzerdefinierten Polydimethylsiloxan-Formen, die für die Herstellung von Hydrogel-basierte Technische Gewebe mit komplexen Geometrien verwendet werden können. Wir beschreiben außerdem Ergebnisse aus mechanischen und histologischen Bewertungen auf veränderter kardialen Gewebe hergestellt, mit dieser Technik durchgeführt.

Custom-Engineered Tissue Culture Formen von gelasert meistern

Wir zeigen eine neuartige Methode für das Konstruieren einer Einzel-Zell-basierte 3-dimensionale (3D) Montage ohne eine künstliche Gerüst.

Bearbeiten von lebenden Zellen, stabile zelluläre 3D-Baugruppe ohne künstlichen Gerüst zu bauen

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung von künstlichem Bindegewebe für eine Parallelkultur von 48 Geweben in einer Multi-Well-Platte mit Doppelpolen vorgestellt, die für mechanistische Studien, Krankheitsmodellierung und Screening-Anwendungen geeignet ist. Das Protokoll ist kompatibel mit Fibroblasten aus verschiedenen Organen und Spezies und wird hier mit menschlichen primären kardialen Fibroblasten veranschaulicht.

Fibroblasten-abgeleitetes Human Engineered Connective Tissue für Screening-Anwendungen

Darin demonstrieren wir ein dreistufiges Organoidmodell (zweidimensionale [2D]-Expansion, 2D-Stimulation, dreidimensionale [3D]-Reifung), das ein vielversprechendes Werkzeug für die Sehnengrundlagenforschung und eine potenziell gerüstfreie Methode für das Tendon Tissue Engineering bietet.

Demonstration einer selbstorganisierten Zellblattkultur und manuelle Generierung eines 3D-Sehnen-/Ligamenten-ähnlichen Organoids unter Verwendung humaner dermaler Fibroblasten

Erfahren Sie die gerichtete zelluläre Selbstassemblierung zur Herstellung von Gewebesegmenten für biomechanische Analysen. Diese Methode nutzt glatte Muskelzellen in Agarose-Vertiefungen für Tissue-Engineering-Anwendungen.

Directed Cellular Self-Assembly to Cell-Derived Tissue Ringe für biomechanische Analyse und Tissue Engineering Fabricate

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