Name: Revealing Neural Circuits Topographie in Multi-Color (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Erfahren Sie die In-vivo-Tracing-Methode mit WGA-Alexa-Fluorophoren zur Kartierung neuronaler Schaltkreise im Kleinhirn, Kortex und Rückenmark. Dieses Protokoll ermöglicht schnelle bidirektionale Tracer-Transporte und hochauflösende Ganzpräparat-Bildgebung.

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Diese Arbeit wurde vom neuen Ermittler Anschubfinanzierung von Albert Einstein College of Medicine der Yeshiva University RVS unterstützt.

<ol><li>Apps, R., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+cortical+organization%3A+a+one-map+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).</li>
<li>Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+spinocerebellar+projection+in+the+prenatal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse.</a> J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).</li>
<li>Mesulam, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMesulam%2C+M+%22Tracing+neural+connections+with+horseradish+peroxidase%22">Tracing neural connections with horseradish peroxidase</a>. , Wiley. New York. (1982).</li>
<li>Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+expression+of+a+cocaine-+and+amphetamine+regulated+transcript+%28CART%29+peptide+reveals+complex+circuit+topography+in+the+rodent+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Patterned expression of a cocaine- and amphetamine regulated transcript (CART) peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex.</a> Journal of Comparative Neurology. , (2011).</li>
<li>Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+mapping+of+afferent+topography+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Struct.+Funct%22%5BJournal%5D)">Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions.</a> Brain. Struct. Funct. , (2011).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Stephen, D., Lao, Z., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed+homeobox+genes+determine+the+organization+of+Purkinje+cell+sagittal+stripe+gene+expression+in+the+adult+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Engrailed homeobox genes determine the organization of Purkinje cell sagittal stripe gene expression in the adult cerebellum.</a> J. Neurosci. 28, 12150-12162 (2008).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Vogel, M. W., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed+homeobox+genes+regulate+establishment+of+the+cerebellar+afferent+circuit+map%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Engrailed homeobox genes regulate establishment of the cerebellar afferent circuit map.</a> J. Neurosci. 30, 10015-10024 (2010).</li>
<li>Vig, J., Goldowitz, D., Steindler, D. A., Eisenman, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentation+of+the+reeler+cerebellum%3A+segregation+and+overlap+of+spinocerebellar+and+secondary+vestibulocerebellar+fibers+and+their+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compartmentation of the reeler cerebellum: segregation and overlap of spinocerebellar and secondary vestibulocerebellar fibers and their target cells.</a> Neuroscience. 130, 735-744 (2005).</li>
<li>Vogel, M. W., Prittie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+spinocerebellar+mossy+fiber+projections+are+maintained+in+the+lurcher+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Topographic spinocerebellar mossy fiber projections are maintained in the lurcher mutant.</a> J. Comp. Neurol. 343, 341-351 (1994).</li>
<li>Voogd, J., Broere, G., van Rossum, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+medio-lateral+distribution+of+the+spinocerebellar+projection+in+the+anterior+lobe+and+the+simple+lobule+in+the+cat+and+a+comparison+with+some+other+afferent+fibre+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Psychiatr.+Neurol.+Neurochir%22%5BJournal%5D)">The medio-lateral distribution of the spinocerebellar projection in the anterior lobe and the simple lobule in the cat and a comparison with some other afferent fibre systems.</a> Psychiatr. Neurol. Neurochir. 72, 137-151 (1969).</li>
<li>Wu, H. S., Sugihara, I., Shinoda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+patterns+of+single+mossy+fibers+originating+from+the+lateral+reticular+nucleus+in+the+rat+cerebellar+cortex+and+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Projection patterns of single mossy fibers originating from the lateral reticular nucleus in the rat cerebellar cortex and nuclei.</a> J. Comp. Neurol. 411, 97-118 (1999).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben die operative und technische Details für eine erfolgreiche axonalen und dendritischen Tracing unter Verwendung eines neuartigen Fluoreszenz-basierten Ansatz für die schnelle Kennzeichnung neuronalen Projektionen in der Entwicklung und erwachsenen Mäusen erforderlich beschrieben. Mit WGA-Alexa zeigen wir, wie Tracer und Marker für die Analyse von strukturierten Topografie elektrischer Schaltungen mit hoher Auflösung und in drei Dimensionen verwendet werden kann. Viele Indikatoren si...

<table border="1"><tbody><tr><td> Equipment / Reagenzien </td><td> Model / Katalog-Nummer </td><td> Firma </td></tr><tr><td> Bead-Sterilisator </td><td> Modell Steri 250 Cat. # 18000-45 </td><td> Feine Science Tools </td></tr><tr><td> Cauterizer </td><td> Cat. # 18000-00 </td><td> Feine Science Tools </td></tr><tr><td> Borosilikatglas Kapillaren </td><td> Cat. # 300056 </td><td> Harvard Apparatus </td></tr><tr><td> Zweistufige Glasmikropipette Puller </td><td> Modell 001-PC-10 </td><td> Narishige </td></tr><tr><td> Mikrometer Spritze </td><td> Cat. # GS-1100 </td><td> Gilmont Instruments </td></tr><tr><td> Small Animal stereotaktische Instrument </td><td> Modell 940-A </td><td> Kopf Instrumentation </td></tr><tr><td> Electrode Manipulator </td><td> Modell 960 </td><td> Kopf Instrumentation </td></tr><tr><td> Vetcare Kammer </td><td> Cat. #340508 </td><td> Harvard Apparatus </td></tr><tr><td> Heizkissen </td><td> Cat. # 341241 </td><td> Harvard Apparatus </td></tr><tr><td> Leica DFC360 FX Kamera </td><td> DFC360 FX </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica DFC490 Kamera </td><td> DFC490 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica DM5500 Mikroskop </td><td> DM5500 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica DFC3000 FX-Kamera </td><td> DFC3000 FX </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Leica MZ16 FA-Mikroskop </td><td> MZ16 FA </td><td> Leica </td></tr><tr><td> CY3 Filter </td><td> Model # 11600231 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> FITC Filter </td><td> Model # 11513880 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> A4 DAPI / UV-Filter </td><td> Model # 11504162 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Weizenkeimagglutinin, Alexa Fluor 488-Konjugat </td><td> Cat. # W11261 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Weizen germ Agglutinin, Alexa 555-Konjugat </td><td> Cat. # W32464 </td><td> Invitrogen </td></tr></tbody></table>

revealing neural circuits topographie in multi-color

Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color

Neuronale Schaltkreise sind in funktionale topografische Karten organisiert. Um komplexe Schaltung Architektur visualisieren wir entwickelten einen Ansatz, um zuverlässig Etikett der globalen Strukturierung von mehreren topographischen Projektionen. Das Kleinhirn ist ein ideales Modell, um die geordnete Anordnung der neuronalen Schaltkreise zu untersuchen. Zum Beispiel hat die räumliche Organisation der spinozerebellären Moosfasern sich als unverzichtbare System für das Studium Moosfaser Strukturierung werden. Wir konnten kürzlich zeigen, dass Weizenkeimagglutinin (WGA) konjugiert Alexa 555 und 488 können für die Rückverfolgung spinozerebellären Moosfaser Projektionen in der Entwicklung und erwachsenen Mäusen verwendet werden (Reeber et al. 2011). Wir fanden drei großen Eigenschaften, die die WGA-Alexa Tracer wünschenswert Tools machen für die Kennzeichnung neuronalen Projektionen. Erstens sind Alexa Fluorophore intensive und ihre Helligkeit lässt wholemount Bildgebung direkt nach Tracing. Zweitens Label WGA-Alexa Tracer die gesamte Flugbahn des sich entwickelnden und adulten neuralen projections. Drittens WGA-Alexa Tracer sind schnell in beide retrograde und anterograde Richtungen transportiert. Hier beschreiben wir detailliert, wie die Tracer und andere erforderliche Tools, wie die Operation für spinozerebellären Tracing durchführen und wie man am besten zum Bild zurück Projektionen in drei Dimensionen vorzubereiten. Zusammenfassend stellen wir eine Schritt-für-Schritt-Tracing-Protokoll, das von Nutzen sein wird für die Entschlüsselung der Organisation und Vernetzung der funktionellen Karten nicht nur im Kleinhirn, sondern auch in der Hirnrinde, Hirnstamm und Rückenmark.

Wir bieten eine praktische Anleitung für die Bereitstellung von Tracer<em&gt; In vivo</em&gt; Und die spinozerebellären Weg als Modellsystem, um wesentliche Schritte für eine erfolgreiche Analyse neuronaler Schaltkreise in Mäusen zu demonstrieren. Wir beschreiben im Detail unsere vielseitigen Tracing-Protokoll, das Weizenkeimagglutinin (WGA) konjugiert Alexa Fluorophore Exploits.

Revealing Neural Circuits Topographie in Multi-Color

Neurale Schaltkreise sind in funktionalen topografischen Karten organisiert. Um komplexe Schaltkreisarchitekturen zu visualisieren, haben wir einen Ansatz entwickelt, um zuverlässig ...

Dieses Verfahren beschreibt ein vielseitiges in vivo-Tracing-Protokoll, das Weizenkeim-Glutinin, konjugiert mit Alexa-Fluorophoren, nutzt, um neuronale Schaltkreise nachzuverfolgen. Zunächst wird ein Schnitt in den unteren thorakalen und oberen lumbalen Bereich durchgeführt, und die Faszie sowie die oberflächlichen Rückenmuskeln werden durchtrennt. Im zweiten Schritt erfolgt eine dorsale Laminektomie.Danach wird die Mikroelektrode eingerichtet und am Mikromanipulator befestigt. Anschließend erfolgt die Druckinjektion von neuronalen Tracern in das Rückenmark. Der letzte Schritt dieses Verfahrens besteht darin, während der Erholungsphase eine angemessene postoperative Versorgung sicherzustellen und ausreichend Zeit für den Transport der Tracer entlang der Zielbahnen einzuräumen.Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Organisation und Konnektivität topographischer Karten in der Kleinhirnrinde, im Hirnstamm und im Rückenmark mittels Immunfluoreszenzmikroskopie zeigen. Der Hauptvorteil dieses Tracers gegenüber bestehenden Tracern wie BDA oder W-G-A-H-R-P besteht darin, dass WGA-Alexa-Tracer hell genug sind, um unmittelbar nach der Markierung eine Abbildung der gesamten Präparation zu ermöglichen. Diese Methode könnte helfen, zentrale Fragen im Bereich der Systemneurowissenschaft zu beantworten, beispielsweise welche Logik der globalen Musterverteilung mehrerer topographischer Projektionen innerhalb und zwischen kortikalen, zerebellären, hirnstamm- und rückenmarksnahen Systemen zugrunde liegt, bevor mit dem Verfahren begonnen wird.Stellen Sie sicher, dass alle Manipulationen den iacuc-Richtlinien entsprechen, dass ein steriles Feld für die Operation zur Verfügung steht und dass alle verwendeten Instrumente sterilisiert wurden. Nach der Verabreichung eines zugelassenen Anästhetikums an das Tier sind steriles chirurgisches Vorgehen und Technik während der gesamten Operation einzuhalten; überprüfen Sie, ob eine geeignete Anästhesietiefe erreicht wurde, indem Sie einen Zehenquetschtest durchführen. Der Pedalreflex sollte verschwunden sein, sobald das Tier vollständig anästhesiert ist.Rasieren Sie das Fell über dem Operationsbereich mit Haarschneidemaschine. Legen Sie das Tier anschließend mit der Bauchseite nach oben auf ein steriles Mulltuch, wobei Sie ein kreisförmiges Muster von innen nach außen verwenden. Wischen Sie den rasierten Bereich mit zwei Sets Alkoholtupfern ab, gefolgt von 70 % Alkohol-Betadine.Danach erneut mit Alkoholtüchern abwischen und das Operationsfeld deutlich abgrenzen, indem ein steriler Mulltupfer mit einer kleinen ausgeschnittenen Öffnung über das Tier gelegt wird, nachdem das Tier ordnungsgemäß präpariert wurde. Auf diese Weise fortfahren zur Operation und die korrekte sterile chirurgische Technik beibehalten. Die Haut mit einer Pinzette anheben und einen Schnitt mit der Schere in der Mittellinie unmittelbar oberhalb der unteren thorakalen, oberen lumbalen Region durchführen.Schneiden Sie die Faszie und die oberflächlichen Rückenmuskeln gegebenenfalls durch und stillen Sie jede Blutung durch Kauterisierung der Blutgefäße. Identifizieren Sie anschließend den Mittelpunkt zwischen dem Gelenkfortsatz und dem dorsalen Dornfortsatz und schneiden Sie hier beidseits der Wirbelsäule die Laminektomie. Führen Sie danach eine dorsale Laminektomie durch, indem Sie die Dornfortsätze von ein oder zwei Segmenten des unteren thorakalen und oberen lumbalen Rückenmarks entfernen.Unter Verwendung einer Mikrometer-Spritze füllen Sie eine gebündelte Glaspipette mit dem Tracer. Danach befestigen Sie die Glas-Mikroelektrode fest auf einem Mikromanipulator. Füllen Sie anschließend die Nadel mit den Reagenzien. Führen Sie die gepoolte Pipette 0,1 bis 0,5 Millimeter in den unteren thorakalen oberen lumbalen Bereich des Rückenmarks ein. In der Mitte zwischen der Mittellinie und dem lateralen Rand des Rückenmarks injizieren Sie unter Druck etwa 0,5 Mikroliter einer 2 %igen Lösung von Weizenkeim-Agglutinin-LOR-Konjugat, Weizenkeim-Agglutinin-Horseradish-Peroxidase-Konjugat oder eines 10 %igen biotinylierten Dextranamins in PBS, ergänzt mit 0,5 % Fast Green, über einen Zeitraum von drei bis fünf Minuten. Wenn der Tracer nicht leicht aus der Pipette austritt, ziehen Sie die Spitze langsam zurück, um eine kleine Tasche im Gewebe zu bilden.Danach nach Abschluss der Mikroinjektion erneut versuchen, zu injizieren. Die Haut vorsichtig mit Wundclips und Gewebekleber verschließen. Anschließend das Tier in eine Erholungskammer auf einer Heizplatte legen.Überwachen Sie die Atemfrequenz und prüfen Sie, ob Anzeichen dafür erkennbar sind, dass das Tier versucht, sich zu bewegen. Nachdem das Tier sich von der Anästhesie erholt hat, bringen Sie es in den Heimkäfig zurück und stellen Wasser und Futter ad libitum sowie Analgetika nach Bedarf zur Verfügung. Kontrollieren Sie routinemäßig auf Anzeichen von Schmerzen, Unbehagen oder Infektionen sowie auf ausreichendes Fressen und Trinken. Tiere, die mit Weizenkeim-Glutin und Konjugat-Tracern injiziert wurden, werden getötet.24 Stunden nach der Mikroinjektion. BDA erfordert typischerweise längere Überlebenszeiten, um neuronale Projektionen vollständig aufzuzeichnen, und daher auch die vollständige Kartierung der spinocerebellären Projektionen. Diese Tiere werden nach etwa 11 Tagen getötet.Weizenkeim-Glutelin-Alexa-Tracer wurden in das untere thorakale und obere lumbale Rückenmark injiziert. Dieses Schema veranschaulicht den Ursprung und die Endigung des Weizenkeim-Glutelins. Mit Alexa 55 markierte spinocerebelläre Neurone.Diese Abbildung zeigt die Injektionsstelle nach der Applikation von Weizenkeimagglutinin Alexa 555 in den unteren thorakalen, oberen lumbalen Bereich des erwachsenen Rückenmarks. Dieses Ganzpräparat-Bild zeigt die vorderen Lappen nach der Injektion von Weizenkeimagglutinin.Alexa 555 in den unteren thorakalen und oberen lumbalen Bereich des Rückenmarks injiziert. Läsionen sind durch römische Ziffern gekennzeichnet. Hier sehen wir, dass die anterograd verfolgte Wheat-Germa-Glutinin-Alexa-555-Markierung der spinocerebellären Bahn definierte Bänder von Moosfasern offenbart, wie in diesem koronaren Gewebeschnitt zu erkennen ist.Dieses Schema des Mausenzerebellums fasst das allgemeine Muster des spinocerebellären Verlaufs zusammen. Moosfaserbänder wurden mit wheatgermagluten in Alexa 555 auf der rechten Seite des lumbalen Rückenmarks und mit wheatgermagluten in Alexa 488 im gleichen Segment auf der linken Seite injiziert, wie auf einem koronaren Gewebeschnitt durch die hintere LOEs zu sehen ist.Beide Weger-Agglutinin-Alexa-Tracer wurden in den Kleinhirnlappen transportiert und markierten erfolgreich unterschiedliche Teilpopulationen von Moosfaserendigungen, hauptsächlich in der Granularschicht, die als GCL gekennzeichnet ist. Weger-Agglutinin-Alexa-Tracer können in Kombination mit Immunhistochemie und Histologie zur dreifachen Markierung von Neuronen und Projektionen verwendet werden. Hier wurde Weger-Agglutinin-Alexa 555 in Moosfaserendigungen im Labial drei abgelagert. Diese Aufnahme mit höherer Vergrößerung des eingerahmten Bereichs zeigt eine deutliche Markierung der Moosfaserendigungen.Dieses Bild der Zein-Zwei-Färbung zeigt eine Anordnung von Bikini-Zellstreifen in Lole drei. Dieses Bild mit höherer Vergrößerung des markierten Bereichs veranschaulicht eine klare Markierung der Bikini-Zellen in der Bikini-Zellschicht und der molekularen Schicht. Hier zeigt die DPI-Färbung neuronale und gliale Kerne.Dieses Bild mit höherer Vergr&ouml;&szlig;erung des markierten Bereichs zeigt eine intensive Markierung der kernreichen Granularzellschicht und der Bikinizellschicht sowie eine weniger dichte Markierung in der Molekularschicht. Dargestellt ist hier eine dreifache Markierung mittels Weizenkeimagglutinin, Alexa 555, Serin zwei und DAPI von afferenten B&auml;ndern, Bikinizellstreifen und der allgemeinen Gewebearchitektur. Abschlie&szlig;end verdeutlicht dieses Bild mit h&ouml;herer Vergr&ouml;&szlig;erung des markierten Bereichs eindrucksvoll die Leistungsf&auml;higkeit dieser Methode zur Darstellung der zytologischen Architektur von Gehirnstrukturen.Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von 20 Minuten pro Tier durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, das Gewebe unmittelbar nach dem Schneiden abzubilden. Obwohl auch die Bildgebung innerhalb von zwei Tagen nach dem Schneiden es ermöglicht, markierte Fasern und Endigungen erfolgreich abzubilden, folgt man diesem Verfahren.Andere Methoden wie die genetische Herkunftsverfolgung können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise welche Projektionsmuster und Endigungsmuster genetisch definierter Zellpopulationen vorliegen.

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