Imaging neuronalen Antworten in Scheiben Zubereitungen von Vomeronasalorgan Ausdruck eines genetisch kodierte Kalzium-Sensor

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Vorbereitung von lebenden Gewebeschnitten zur Abbildung von Pheromonantworten in Neuronen des MRO-Nasalorgans zu veranschaulichen. Dies wird erreicht, indem zunächst lebende Gewebeschnitte des MRO-Nasalorgans oder des VNO von Mäusen vorbereitet werden, die einen genetischen Kalziumindikator GCaMP zwei exprimieren. Im nächsten Schritt wird das Perfusionsystem auf dem Mikroskoptisch eingerichtet, um den Schnitt zu stabilisieren, Reize zuzuführen und die Bildaufnahme durchzuführen.

Die Antwort. Anschließend wird ein Zeitrafferaufnahmeversuch mit verschiedenen Pheromonreizen durchgeführt, gefolgt von der Datenanalyse der Bildgebungsergebnisse. Letztendlich werden die Antwortmuster von VNO-Neuronen auf unterschiedliche Pheromonreize ermittelt.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Kalzium-D-Beladung oder der Bildgebung in dissoziierten Zellen besteht darin, dass wir die intakte Zellmorphologie erhalten, die Gesundheit der Schnitte besser bewahren und ein stärkeres Signal erzielen können. Diese Methode kann uns helfen, einige der zentralen Fragen in der Erforschung des warmen Riechsystems zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung von Liganden und deren Rezeptoren sowie die Profilierung der individuellen Reaktionen von Riechneuronen des Fadenwurms. Die Methode kann außerdem auf andere Systeme angewandt werden, wie beispielsweise das olfaktorische System, das Serum oder die zerebrale Psoriasis.

Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da es schwierig ist, eine gute Psoriasis zu erhalten und das Perfusionsystem einzurichten. Bevor Sie dieses Verfahren beginnen, bereiten Sie die erforderlichen Lösungen vor, einschließlich der Maus, künstlicher zerebrospinaler Ringer-Lösung, 4 % Low-Melting-Agarose und Pheromon-Reize gemäß dem beigefügten Manuskript. Stellen Sie dann zwei Röhrchen mit Low-Melting-Agarose auf einen Heizblock.

Stellen Sie die Temperatur auf über 60 Grad Celsius ein, um die Aros zu schmelzen. Nachdem das Gel flüssig geworden ist, überführen Sie die Röhrchen in einen 37 Grad Celsius warmen Wärmehalter. Um die VNO-Schnitte vorzubereiten.

Nachdem ein euthanasiertes GCaMP-Zwei-Maus entgephauptet wurde, schneiden Sie mit einer Schere die Unterkieferknochen durch, um den Unterkiefer zu entfernen. Danach entfernen Sie das geriffelte Gewebe des oberen Gaumens, um die Nasenhöhle freizulegen. Trennen Sie anschließend die Kieferknochen, indem Sie ein chirurgisches Skalpell zwischen die beiden vorderen Schneidezähne einführen.

Entfernen Sie vorsichtig den Kieferknochen, um das VNO freizulegen. Heben Sie zu diesem Zeitpunkt das gesamte VNO durch Halten am Steißbein aus der Nasenhöhle an. Überführen Sie das VNO in eine kalte, mit Sauerstoff angereicherte Maus-Lösung (A CSF-Lösung).

Unter dem Dissektionsmikroskop die beiden VNO unmittelbar voneinander trennen, indem die Spitzen der Pinzette vorsichtig entlang der Wand des Septumknochens geschoben werden. Den knöchernen Überzug entfernen, der das VNO-Gewebe umgibt. Anschließend das gesamte VNO-Gewebe vorsichtig aus der knöchernen Vertiefung anheben.

Bei diesem Schritt ist äußerste Vorsicht geboten, um das Neuroepithel nicht zu beschädigen. Entfernen Sie anschließend vollständig die kleinen Knochenfragmente, die auf der Gewebeoberfläche verblieben sind. Bevor Sie die verbliebenen Fragmente einbetten.

Das Gewebe kann von der Schneidklinge erfasst werden, wodurch es aus dem Agaroseblock herausgezogen wird. Danach halten Sie das hintere Ende des VNO-Gewebes mit der Pinzette fest und tauchen es vorsichtig in die geschmolzene Agarose ein. Kühlen Sie das Röhrchen anschließend schnell auf Eis ab.

Um das Aros zu verfestigen, sollte der Einbettungs- und Abkühlungsprozess weniger als zwei Minuten dauern. Danach beschneiden Sie den Aros-Block, der das VNO enthält, und kleben ihn auf den Gewebeträger. Anschließend setzen Sie den Gewebeträger in den Metallzylinder ein und füllen die verbleibende Kammer mit zusätzlichem Aros mit niedrigem Schmelzpunkt auf.

Nachdem sich das niedrigschmelzende Agarose auf Eis verfestigt hat, fahren Sie unverzüglich mit dem Schneiden fort, indem Sie kalte, mit Sauerstoff angereicherte Maus-A-CSF in die Schneidekammer des Gewebeschneiders geben und die Schnitte in einer Dicke von 180 bis 200 μm anfertigen. Sammeln Sie die Schnitte anschließend und überführen Sie sie in die Inkubationskammer. Die Schnitte sind sechs bis acht Stunden lang in der mit Sauerstoff angereicherten Maus-A-CSF bei Raumtemperatur verwendbar.

Legen Sie bei diesem Verfahren zuerst einen VNO-Schnitt in die Mitte der Perfusionskammer und befestigen Sie den Schnitt mit einem Schnitt-Halter. Die Drähte des Halters sollten nur gegen den Teil des Schnitts mit dem Low-Melting-Agarose drücken, nicht jedoch gegen das VNO-Gewebe. Anschließend leiten Sie das oxygenierte Maus-A-CSF über den Zulauf der Perfusionskammer mit etwa 100 Mikrolitern pro Sekunde zu.

Die Flüssigkeit wird über eine Absaugnadel durch die Auslassöffnung abgeführt, um einen kontinuierlichen Fluss von frischer Maus-A-CSF zu gewährleisten. Füllen Sie anschließend eine 30-Milliliter-Spritze mit Ringer-Lösung und befestigen Sie sie am Spritzenpumpenapparat. Stellen Sie die Pumpgeschwindigkeit auf 300 bis 600 Mikroliter pro Minute ein.

Um einen kontinuierlichen Fluss von Ringer-Lösung über den Schnitt zu gewährleisten, verbinden Sie den Ausgang des Ringerns mit der A-H-P-L-C-Injektionsschleife. Die Steuerung der Injektionsschleife verfügt über zwei Durchflusswege. In der Ladeposition wird die Probe der Mausurin mit einer Präzisions-Mikro-Spritze von Hamilton in die Probenkammer geladen.

Überschüssige Probe verlässt die Probenanlage über den Abfluss. Die von der Spritzenpumpe injizierte Ringer-Lösung umgeht die Probenanlage und gelangt direkt zum Auslass, der in der Injektionsposition mit der Perfusionsnadel verbunden ist. Die Pumplösung strömt durch die Probenanlage und drückt die Pheromonreize in den Auslass.

Vor dem Bildgebungsversuch. Entfernen Sie die Luftblasen, um einen gleichmäßigen Durchfluss der Perfusionsflüssigkeit sicherzustellen. Danach justieren Sie die Perfusionsnadel unter einem 5x- oder 10x-Objektiv so, dass die Nadel etwa einen Millimeter vom Gewebeschnitt entfernt ist.

Um die Verzögerungszeit der Probe und die Dauer zu messen, laden Sie mit fluoreszierendem Farbstoff 0,1 % Rhodamin 6G-Farbstoff in die Proben-Schleife. Schalten Sie dann das Ventil in die Injektionsposition. Fünf Sekunden nach Beginn der Bildaufnahme detektieren Sie das fluoreszierende Signal zwischen 10 und 30 Sekunden.

Die glatte Kurve des Fluoreszenzsignals zeigt auch an, dass unter der eintauchenden Linse kaum Turbulenzen entstehen und dass eine ausreichende Perfusion mit oxygeniertem Maus-A-CSF in unserem Labor das Schnittpräparat erreicht. Für die Zeitrafferaufnahmen zur Detektion von GAMP zwei-Signalen wird das Zeiss Axio scope FS zwei Mikroskop mit einer 10×- oder 20×-Wassereintauchlinse verwendet. Der standardmäßige GFP-Bandpassfilter von 450 bis 490 Nanometern kommt zum Einsatz.

Die epi-fluoreszenten Bilder werden mit einer CCD-Kamera aufgenommen, wobei je nach Expressionsebenen von GCaMP zwei eine 1×1- oder 2×2-Spinneinstellung verwendet wird. Stellen Sie zunächst die Aufnahmegeschwindigkeit auf einen Bilderrahmen pro Sekunde ein. Passen Sie die Lichtintensität so an, dass die Auslöschung der GCaMP zwei-Signale und photoinduzierte Zellschäden minimiert werden.

Schalten Sie dann das Ventil zu einem bestimmten Zeitpunkt in die Injektionsposition, um bei allen Versuchen innerhalb eines Experimentdurchlaufs konsistente Zeitverzögerungen zu erzielen. Führen Sie nun einen Testlauf mit Ringer-Lösung als Reiz durch und justieren Sie die Perfusionsanordnung neu, falls während der Probeninjektion Bewegungsartefakte auftreten. Führen Sie danach einen positiven Kontrolllauf mit mausigem Urin durch, der in Lösung im Verhältnis 1 zu 100 verdünnt wurde, um Kreuzkontaminationen zwischen verschiedenen Proben zu vermeiden.

Spülen Sie die Hamilton-Spritze nach dem Beladen mit einem Stimulus mindestens dreimal mit Ringer-Lösung. Ebenso spülen Sie die Probenschleife zwischen verschiedenen Reizen vor der Anwendung mindestens dreimal mit Ringer-Lösung. Warten Sie beim nächsten Stimulus vier bis zehn Minuten, bis sich die MRO-Riechnervenzellen erholt haben, um die Bildregistrierung aller von einem Schnitt aufgenommenen Bilder durchführen zu können.

Ein benutzerdefiniertes, in VBA geschriebenes Skript in Avision wird verwendet, um diesen Prozess zu automatisieren. In diesem Fall werden alle Bildrahmen innerhalb desselben Experiments gegen einen gemeinsamen, ausgewählten Referenzrahmen mit elastischer Verformung registriert, um eine Bildsubtraktion durchzuführen und die reagierenden Zellen zu identifizieren. Die benutzerdefinierten Makros in ImageJ Version 1.42 dienen zur Automatisierung dieses Vorgangs.

Für jeden Stack wird ein minimales Projektionsbild generiert, und die reagierenden Zellen werden sichtbar, nachdem die minimale Projektion von den rohen Stacks subtrahiert wurde. Anschließend wird der interessierende Bereich (ROI) aus den subtrahierten Stacks identifiziert und die ROI-Koordinaten mithilfe des Multi Measure-Plugins von ImageJ ermittelt. Danach werden alle Stacks eines Experiments verarbeitet und alle ROI-Koordinaten in einer übergeordneten ROI-Liste gespeichert. Im Anschluss werden mit Hilfe dieser übergeordneten ROI-Liste die Zellantworten in den rohen Bildstapeln mithilfe eines benutzerdefinierten Makros und des Multi Measure-Plugins von ImageJ gemessen. Schließlich werden die Antwortkurven und die Heatmap in Matlab dargestellt.

Hier wird ein Beispiel für ein VNO-Bildgebungs-Experiment unter Verwendung von Urinproben gezeigt, die von vier einzelnen Mäusen gesammelt wurden. Etwa 80 Zellen zeigen eine Reaktion auf mindestens einen der Urinreize, und ihre Antwort (delta F geteilt durch F) ist in der Heatmap dargestellt. Hier sind die Antwortkurven der Zellen eins, zwei und drei, die den zeitlichen Verlauf der Aktivierung durch Urinreize zeigen. Zelle eins reagiert auf beide Urinproben von weiblichen Tieren, nicht jedoch auf die Proben von männlichen Tieren.

Während Zelle zwei das entgegengesetzte Aktivierungsmuster aufweist und auf beide männlichen Proben anspricht. Wird nur Zelle drei durch individuelle männliche und weibliche Proben aktiviert. Einmal angefertigt, kann der Schnitt in 30 Minuten vorbereitet werden, und die Piano-Neuronen können sechs bis acht Stunden lang am Leben erhalten werden, wenn das Verfahren ordnungsgemäß durchgeführt wird.

Während der Durchführung dieser Methode ist es wichtig, daran zu denken, reagenziengerechte Substanzen für die Gewebekultur zu verwenden und Reagenzien zur Gewebefixierung zu vermeiden, wenn sie mit den Gewebeproben in Kontakt kommen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie lebendes Psoriasis-Gewebe für die Bildgebung thermischer Reaktionen in Wiener Neuronen unter Verwendung von Mäusen mit G-Camp-Expression vorzubereiten ist.