Name: Selektieren und Isolieren Colonies of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus adulten Fibroblasten Umprogrammierte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 23 s
Description: Lernen Sie die Reprogrammierung humaner Fibroblasten zu induzierten pluripotenten Stammzellen mittels retroviraler Vektoren. Diese Methode nutzt TRA-1-81-Färbung zur Identifikation erfolgreicher Kolonien.

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Diese Arbeit wurde von Friedreich-Ataxie Research Alliance und einer Pilot-Zuschuss von Arnold Family Foundation und dem Zentrum für Stammzellen und Entwicklungsbiologie am MD Anderson Cancer Center unterstützt.

1. Virus Produktion und Transduktion <ol><li> Tafel Phoenix Ampho-Zellen bei einer Dichte von ~ 7-8x10 6 pro 10 cm Platte in 10 ml DMEM-Medium (DMEM hohe Glucose, 10% Hitze-inaktiviertem FBS, 2 mM L-Glutamin, keine Antibiotika). Platz im Inkubator und Kultur über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Am nächsten Tag Transfektion Phoenix Zellen unter Verwendung von 12 ug einem Vektor, der entweder Oct3 / 4, Sox2, Klf4, c-myc oder GFP-Gen (Addgene Plasmide 17.217, 17.218, 17.219, 17.220) und 35 ul Fugene 6. Planen Transfektionsgemisch in 500 ul DMEM-Medium (DMEM hohe Glucose, 2 mM L-Glutamin, nicht FBS und Antibiotika). Inkubieren 20 min. Vorsichtig pipettieren DNA-Komplexe in die 10 cm-Platten mit 70-80% konfluenten Phoenix-Zellen. </li><li> Ersetzen Medien 6 - 8 h nach der Transfektion mit DMEM-Medium (DMEM high glucose, 10% FBS hitzeinaktiviertem, 2 mM L-Glutamin) mit Penicillin und Streptomycin. </li><li> Anschließend sammeln Virus-haltigen Medien 4-mal in 12 hIntervalle, kombinieren alle Teile und durch ein 0,45 um-Filter, um abgelösten Zellen und Ablagerungen (Medien mit viralen Partikeln kann im Kühlschrank bei 2 Wochen, ohne dass infektiöse Aktivität gehalten werden, jedoch Einfrieren wird nicht empfohlen) entfernen. </li><li> Für retrovirale Transduktion, Platte humanen adulten Fibroblasten (Passage 10, Coriell Laboratories) aus einem gefrorenen Lager 24 h vor dem letzten Tag des retroviralen Mediensammlung. Seed die Zellen auf 6-Loch-Platten abgedeckt Gelatine mit einer Dichte 1x10 5 Zellen pro Vertiefung in DMEM hohe Glucose, 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, Penicillin, Streptomycin und nicht-essentiellen Aminosäuren. </li><li> Am nächsten Tag Ersatz DMEM-Medium mit Medien, die viralen Partikel aus Phoenix-Zellen erhalten. Fügen Sie viralen Medien (1 ml jeder Oct4, Sox2, Klf4, und c-myc-Medien, insgesamt 4 ml) mit 6 pg / ml Polybren in jedes Well der 6-Well-Platte der Fibroblasten-Kulturen und Zentrifuge ergänzt bei 1600g für 1h bei 20 ° C Etwa 12 h after die Transduktion, ersetzen Sie die viralen Medien mit Fibroblasten-Kulturmedium. Führen Virusinfektion und Zentrifugation 3-mal in 24 h Intervallen. </li><li> Kultur Fibroblasten in DMEM-Medium für 48 h nach der letzten Infektion. Die Effizienz der Infektion durch parallele Transduktionen mit einem retroviralen Medien, die GFP exprimieren. 1 zeigt die Effizienz der Zentrifugation erleichtert-retroviralen Infektion von humanen Fibroblasten. </li></ol> 2. Reprogrammierung <ol><li> Planen 6-Well-Platten mit γ-bestrahlten MEF-Feeder-Schichten durch Impfen MEF-Zellen bei einer Dichte von ~ 2x10 5 Zellen pro Vertiefung der Gelatine behandelten 6-Well-Platte in Fibroblasten-Wachstumsfaktor Medium. Am folgenden Tag aufgeteilt infizierten menschlichen Fibroblasten unter Verwendung von 0,05% Trypsin / EDTA und entkernen mit einer Dichte von ~ 1.2x10 4 pro auch in der Fibroblasten Wachstumsmedium. </li><li> Am nächsten Tag ersetzen Medien mit hES-Medien (DMEM/F12, 20% Knockout Serumersatz, nicht-essentielle Aminosäuren, penicillin / Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 0,1 mM β-Mercaptoethanol, 20 ng / ml basalen Fibroblast Growth Factor (bFGF), ergänzt mit 0,5 mM Natriumbutyrat für die ersten 7 Tage nach Umprogrammierung. Ändern Medien täglich. </li><li> Überwachen morphologischen Veränderungen in transduzierten Zellen täglich. Kolonien von HIPS-ähnlichen Zellen beginnt zu entstehen ca. 5 - 10 Tage nach der Übertragung der transduzierten Fibroblasten auf Feeder-Zellen. Die hiPSC Kolonien sind bereit, rund 14 isoliert werden - 28 Tage nach dem Ausplattieren sie auf den MEF-Feeder-Zellen. </li></ol> 3. Isolierung von Kolonien hiPSC <ol><li> Einen Tag vor Aufnahme der hiPSC Kolonien herzustellen 24-Well-Platten mit γ-bestrahlten MEF Feeder-Zellen (~ 4x10 4 Zellen pro Vertiefung) in Fibroblasten Wachstumsmedium. In diesem Stadium hiPSC Kolonien können auch auf Feeder-freien Kultur mit Matrigel und mTeSR1 Medium übertragen werden. </li><li> Vor der Isolierung des hiPSC Kolonien herzustellen MEF Platten durch Entfernen Fibroblasten Wachstum Medium und Spülen mit PBS MEFs, um Spuren von FBS zu entfernen. Anschließend werden 0,5 ml HES Medium (oder mTeSR1 Mediums im Falle von Matrigel beschichteten Vertiefungen) mit 10 pM ROCK-Inhibitor Y27632 in jede Vertiefung 7,8. </li><li> Falls erforderlich, die rund um die Fibroblasten hiPSC Kolonien mit einem 21-Gauge-Nadel unter einem Mikroskop in einem Abzug mit laminarer Strömung (2A - C) angebracht ist. Spülen Sie die Platten mit PBS und fügen frische hES-Datenträger mit dem Tra-1-81 StainAlive spezifischen Antikörper (1:200, Stemgent). Nach 30 min., Ersetzen Sie Medien, die den Antikörper mit frischen hES-Medien mit 10 uM ROCK-Inhibitor ergänzt. Untersuchen Sie die Platten unter dem Fluoreszenzmikroskop und Tra-Marke von 1 bis 81 positive Kolonien mit Hilfe einer objektiven Marker (2D). </li><li> Schneiden Sie die Tra-1-81 positive hiPSC Kolonien unter dem Mikroskop in einer Laminar-Haube, in mehrere kleine Stücke mit einer 21-Gauge-Nadel wie in 2E gezeigt und F. </li><li> Verwendung einer automatischen Pipette (P200) Transfer Fragmente von hiPSC Kolonien in individual Vertiefungen der 24-Well-Platte mit MEFs oder Matrigel. Vermeiden Sie die Übertragung nicht-HIPS-Zellen. Legen Sie die Platten in einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator und lassen Sie die hiPSC Kolonien für 24-36 h zu befestigen. </li><li> Ändern HES oder mTeSR1 (für Kolonien auf Matrigel gewachsen) Medien täglich. Die Kolonien mit hiPSC richtige HES-Morphologie sichtbar 48 h nach der ersten Übertragung auf einer 24-Well-Platte. </li><li> Manuelles Durchgang hiPSC Kolonien alle 6 - 8 Tage auf einer 12-Well und anschließend auf einem 6-Well-Platte. </li><li> Nach klonale Expansion und zur Festlegung hiPSC Linien, zu analysieren Expression von Markern für Pluripotenz TRA-1-60, SSEA-4, Oct3 / 4, Sox2 und Nanog Verwendung von Immunocytochemie wie in 3 gezeigt. Bewerten genomischen Integrität und Differenzierungspotential der erhaltenen Linien mit Karyotyp und Teratombildung Analysen 6,9. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Effiziente Transduktion mit Retrovirus-haltigen Medien is die für den erfolgreichen Reprogrammierung. Es wird empfohlen, den gesamten Transfektion / Infektion Verfahren durchzuführen unter Verwendung eines GFP-exprimierenden Virus jede einzelne Anpassung Experiment, um die Effizienz zu überwachen, wie in 1 gezeigt. Der Titer des GFP-exprimierenden Virus bestimmt, wie in 10 beschrieben, durch die Transduktion von humanen Fibroblasten mit nicht-konzentrierten viralen Medien lag typischerweise im Bereich von 0,5 - 5 x 10 7 Viruspartikeln pro ml (vp / ml). Fibroblasten ändern Morphologie bereits 2 Tage nach der letzten Infektion. Trypsiniert humanen Fibroblasten sollte sorgfältig gezählt werden, bevor sie auf die Aussaat MEF Feeder-Zellen. Es ist zu Samenzellen bei 3 verschiedenen Dichten (6x10 3, 4 1.2x10, 2.5x10 4 pro einzelnes Loch einer 6-Well-Platte) empfohlen, da jeder Zelllinie zeigt verschiedene charakteristische Wachstum und Aussaatdichte ist entscheidend für die Effizienz der Reprogrammierung. Natriumbutyrat für die Verwendungersten 7 - 14 Tagen der Umprogrammierung erhöht die Effizienz der Bildung hiPSC ca. 5 fache. Häufig, insbesondere wenn infizierte Fibroblasten in höherer Dichte ausgesät wurden, können die Fibroblasten-ähnliche Zellen überwachsen eine Kulturschale und decken hiPSC Kolonien in 2A gezeigt. In diesem Fall kann die Fibroblasten-Schicht vorsichtig angehoben werden und entfernt, um hiPSC Kolonien (2B) aufzudecken. Anschließend sollte hiPSC Kolonien mit hES-Medien gespült werden und gefärbt mit Tra-1-81 Antikörper. Abhängig von den Fibroblasten-Zellen, ca. 20 - 40% der Kolonien demonstriert mit IPSC-Morphologie nicht mit Tra-1-81 Antikörper färben. 24h - identifiziert hiPSC Kolonien können aus einer Platte innerhalb der nächsten 12 übertragen werden. Längerer Inkubation wird in schnelleren Differenzierung von hiPSCs führen. Die Kolonien können entweder manuell auf Feeder-Zellen oder MEF Matrigel-beschichteten Platten passagiert werden. Nach der Expansion etabliert hiPSC Klone sollte getestet mit Immunzytochemie (ICC) für die Expression von pluripoten werdency-Marker wie in Abbildung 3 gezeigt. Zusätzlich sollte eine detaillierte molekulare Charakterisierung der erzeugten iPS-Zelllinien umfassen: Analysen der Pluripotenz Genexpression mittels RT-PCR, Demonstration der DNA-Demethylierung bei den Promotoren von Pluripotenz-Gene und-analysen der Transgene Silencing-9. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3416/3416fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Die Effizienz der virale Transduktion unter Verwendung GFP-exprimierenden Retrovirus ist. (A, B) Humane adulte Fibroblasten, die von Friedreich-Ataxie Patienten abgeleitet (GM03665, Coriell Repository) wurden sichtbar nach zwei aufeinander folgenden Infektionen mit GFP retroviralen Medien. (C, D) Humane Fibroblasten wurden mit der gleichen Charge der GFP retroviralen Medien durch Zentrifugation der Zellen direkt auf den Platten mit 6 Vertiefungen für 1 Stunde bei 1600g gefolgt infiziert. Die Bilder wurden 48h nach der Infektion eingefangen. <img alt='"Bild' src='"/' files> Abbildung 2. Identifizierung und Isolierung von hiPSC Kolonien. (A) Phasenkontrast-Bild einer Platte mit hiPSCs von Fibroblasten umgeben. Die Zellen wurden für 21 Tage auf hES Medien kultiviert. (B, C) Das gleiche hiPSC Kolonie nach dem Entfernen des umgebenden Fibroblasten-Schicht. (D) korrekt neu programmiert hiPSC Kolonien, die von Live-Färbung mit Tra-Oberfläche 1-81 Marker-Antikörper identifiziert werden, schneiden mit einer sterilen Kanüle (E, F) und in separaten Kammern einer 24-Well-Platte. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3416/3416fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 3"> 3. Expression der Pluripotenz Marker Oct3 / 4, Nanog, Sox2, SSEA4 und Tra-1-60 in hiPSCs wurde durch Immunzytochemie bestimmt.

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Studieren menschlicher Krankheiten, insbesondere neurologische und neurodegenerative, wurde eine besondere Herausforderung aufgrund der Unzugänglichkeit der angemessene personelle zellulären Modellen. Die Fähigkeit, leicht erhältlich Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen umprogrammieren und das Potenzial, um sie in verschiedenen Zelltypen differenzieren eröffnet die Möglichkeit, zelluläre Modelle von genetischen Krankheiten zu schaffen. Darüber hinaus halten IPSCs ein großes Versprechen für die Zukunft der...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11330 </td></tr><tr><td> KSR </td><td> Invitrogen </td><td> 10828 </td></tr><tr><td> Nicht-essentielle Aminosäuren </td><td> Invitrogen </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> Natriumbutyrat </td><td> Sigma </td><td> B5887 </td></tr><tr><td> Y27632 </td><td> Stemgent </td><td> 04-0012 </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> Stemgent </td><td> 03-0002 </td></tr><tr><td> Tra-1-81-Antikörper </td><td> Stemgent </td><td> 09-0069 </td></tr><tr><td> Oct3 / 4 Antikörper </td><td> Santa Cruz </td><td> SC-8628 </td></tr><tr><td> Nanog Antikörper </td><td> Cell Signaling Technology </td><td> 4903S &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Tra-1-60-Antikörper </td><td> Millipore </td><td> MAB4360 </td></tr><tr><td> Sox2 Antikörper </td><td> Cell Signaling Technology </td><td> 3579S </td></tr><tr><td> SSEA4 </td><td> Millipore </td><td> MAB4304 </td></tr><tr><td> CF1 MEFs </td><td> Globalstem </td><td> GSC-6201G </td></tr><tr><td> Ziel-Marker </td><td> Nikon </td><td> MBW10010 </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354277 </td></tr><tr><td> mTeSR1 </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05850 </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Sigma </td><td> M7522 </td></tr><tr><td> Fugene 6 </td><td> Roche </td><td> 11814443001 </td></tr><tr><td> Polybren </td><td> Sigma </td><td> H9268 </td></tr><tr><td> Objekt-Marker </td><td> Nikon </td><td> MBW10010 </td></tr></tbody></table>

selektieren und isolieren colonies of human induzierten pluripotenten stammzellen aus adulten fibroblasten umprogrammierte

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Hier präsentieren wir ein Protokoll der Reprogrammierung erwachsener Mensch menschlichen Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSC) mit retroviralen Vektoren kodieren Oct3 / 4, Sox2, Klf4 und c-Myc (OSKM) in Gegenwart von Natriumbutyrat 1-3. Wir verwendeten diese Methode, um spät Passage neu zu programmieren (&gt; P10) humanen adulten Fibroblasten von Friedreich-Ataxie Patienten abgeleitet (GM03665, Coriell Repository). Die Umprogrammierung beinhaltet hoch effiziente Transduktion Protokoll unter Verwendung von Fibroblasten wiederholte Zentrifugation in Gegenwart von Virus-enthaltenden Medien. Die modifizierte hiPSC Kolonien identifiziert wurden unter Verwendung lebender Immunfärbung für Tra-1-81, ein Oberflächenmarker von pluripotenten Zellen, aus nicht-programmiert Fibroblasten getrennt und manuell passagiert 4,5. Diese hiPSC wurden dann auf Matrigel Platten übertragen und aufgewachsen in Feeder-freien Bedingungen, direkt aus der Umprogrammierung Platte. Ab dem ersten Durchgang, demonstrieren hiPSC charakteristische Kolonien hES-like Morphologie. Unter Verwendung dieses Protokolls mehr als 70% der ausgewählten Kolonien erfolgreich ausgeweitet und festgesetzt werden, in Zelllinien. Die etablierten hiPSC Linien angezeigt charakteristischen Markern für Pluripotenz einschließlich Oberflächenmarker TRA-1-60 und SSEA-4, sowie nukleare Marker Oct3 / 4, Sox2 und Nanog. Das hier vorgestellte Protokoll wurde eingerichtet und getestet mit adulten Fibroblasten von Friedreich-Ataxie Patienten und Kontrollpersonen 6, menschlichen Neugeborenen Fibroblasten, sowie menschliche Keratinozyten erhalten.

Wir präsentieren ein Protokoll für die effiziente Reprogrammierung von menschlichen Körperzellen in die menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) mit retroviralen Vektoren kodieren Oct3 / 4, Sox2, Klf4 und c-Myc (OSKM) und Identifizierung von richtig umprogrammiert hiPSC durch Live-Färbung mit Tra- 1-81 Antikörper ist.

Selektieren und Isolieren Colonies of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus adulten Fibroblasten Umprogrammierte

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Reprogrammierung menschlicher adulter Fibroblasten in menschliche induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSC) unter Verwendung retroviraler Vektoren, die ... kodieren.

In diesem Videoartikel werden humane adulte Fibroblasten mithilfe retroviraler Vektoren zu pluripotenten Stammzellen umprogrammiert. Zunächst werden humane Fibroblasten mit retroviralen Vektoren, die die Transkriptionsfaktoren T three four, SOX two, KLF four und cmic kodieren, transduziert.Die infizierten Fibroblasten werden 14 bis 28 Tage lang auf embryonalen Maus-Stützzellen kultiviert. Die resultierenden Kulturen werden mit dem TRA 180 1-Antikörper gefärbt, um Kolonien reprogrammierter Zellen zu identifizieren. Positive Kolonien werden anschließend in Platten mit MEF zur Vermehrung übertragen.Die immunzytochemische Färbung bestätigt die Expression von Pluripotenzmarkern und die Etablierung pluripotenter Stammzelllinien. Anschließend sollten zusätzliche Untersuchungen durchgeführt werden, um die Linien weiter zu charakterisieren. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in der somatischen Zellreprogrammierung und Kultur humaner induzierter pluripotenter Stammzellen sind, Schwierigkeiten, da es schwer ist, die korrekten iPSC-Kolonien zu identifizieren.Den Versuch wird Dr. Sula Pollak, Post-Doktor O-Stipendiatin aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie den Versuch, indem Sie Pho

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir zeigen das Protokoll für die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Lentivirus-vermittelte Lieferung der menschlichen Faktoren Oct4, Sox2, Nanog und Lin28. Pluripotenz von Morphologie und die Anwesenheit von embryonalen Stammzellen (ES) Zell-spezifische Marker bestätigt.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung menschlichen Fibroblasten mit dem Stemgent Menschliche TF Lentivirus Set

Ein Verfahren für die menschliche induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) über Retrovirus-vermittelte ektopische Expression von Oct4 generieren, wird Sox2, Klf4 und MYC beschrieben. Ein praktischer Weg, um menschliche iPSC Kolonien auf GFP-Expression zu identifizieren Basis wird ebenfalls diskutiert.

Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Isolierung von induzierten neuralen Vorläuferzellen (iNPCs), die aus adulten menschlichen Fibroblasten stammen. Es werden die Schritte beschrieben, die erforderlich sind, um die iNPC-Kolonien zu isolieren und sie in lamininbeschichteten Multi-Well-Plattenvertiefungen in Gegenwart geeigneter Nährmedien zu kultivieren, die die weitere Proliferation und Expansion der iNPC-Population erleichtern.

Isolierung induzierter neuraler Vorläuferzellkolonien, die aus adulten humanen Fibroblasten stammen

Hier präsentieren wir unsere etablierte Methode zur menschlichen Körperzellen in gentechnikfreien menschlichen iPS-Zellen mit Sendai-Virus, das konsequente Ergebnis-und Effizienzsteigerung zeigt neu zu programmieren.

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

Wir beschreiben ein Protokoll zur Gewinnung von lentiviral basierten, reprogrammierten und charakterisierten faktorfreien humanen induzierten pluripotenten Stammzellen und zur Umwandlung in mutmaßliche klinische Bedingungen.

Ableitung und Charakterisierung eines Transgens freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzelllinie und Umwandlung in Definierte Clinical-Grade Bedingungen

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten. Allerdings Progression durch einem pluripotenten Zustand und mühsame Wieder Differenzierung noch behindert klinischen Übersetzung. Hier beschreiben wir die Ableitung der erwachsenen menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umsetzung in induzierten neuronalen Vorläuferzellen und die nachfolgende Differenzierung in neuronale Abstammungen.

Ableitung von Adult menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umwandlung in Erweiterbar neuronalen Vorläuferzellen

Dieses Manuskript bietet ein Schritt-für-Schritt-Verfahren für die Gewinnung und Erhaltung menschlicher Keratinozyten aus gezupftem Haar und die anschließende Erzeugung von integrationsfreien humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) durch episomale Vektoren.

Generation der Integration freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen Mit Haarstamm Keratinozyten

Die robuste Ableitung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS) wurde durch die Verwendung von nicht-integrierenden Sendai-Virus (SeV) -vektorvermittelten Umprogrammierung von dermalen Fibroblasten erreicht. HiPS-Zell-Aufrechterhaltung und Klon-Expansion wurde unter Verwendung von xeno-freien und chemisch definierten Kulturbedingungen mit rekombinantem humanem Laminin 521 (LN-521) -Matrix und Essential E8 (E8) Medium durchgeführt.

Integration Freie Ableitung von human induzierten pluripotenten Stammzellen mit Laminin 521 Matrix

Hier beschreiben wir eine klinisch relevante, hohem Wirkungsgrad, Feeder-free Methode, um menschliche primäre Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen mit modifizierten mRNAs codieren Neuprogrammierung Faktoren neu zu programmieren und Reife MicroRNA-367/302 imitiert. Ebenfalls enthalten sind Methoden zur Beurteilung der Neuprogrammierung Effizienz klonalen iPSC Kolonien zu erweitern, und Ausdruck der Pluripotenz Markierung TRA-1-60 zu bestätigen.

RNA-basierten Reprogrammierung von menschlichen primäre Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen

Die Zellumprogrammierung erfordert die Einführung von Schlüsselgenen, die den pluripotenten Zellzustand regulieren und aufrechterhalten. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Bildung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen dermalen Fibroblasten ohne virale/integrierende Methoden, aber unter Verwendung nicht modifizierter RNAs (NM-RNAs) in Kombination mit Immunumgehungsfaktoren, die die zellulären Abwehrmechanismen reduzieren.

Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Lernen Sie die Reprogrammierung humaner Fibroblasten zu induzierten pluripotenten Stammzellen mittels retroviraler Vektoren. Diese Methode nutzt TRA-1-81-Färbung zur Identifikation erfolgreicher Kolonien.

Selektieren und Isolieren Colonies of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus adulten Fibroblasten Umprogrammierte

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