Selektieren und Isolieren Colonies of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus adulten Fibroblasten Umprogrammierte

In diesem Videoartikel werden humane adulte Fibroblasten so umprogrammiert, dass sie mit retroviralen Vektoren pluripotente Stammzellen erzeugen. Zunächst werden humane Fibroblasten mit retroviralen Vektoren transduziert, die für die Transkriptionsfaktoren kodieren. T drei vier, SOX zwei, KLF vier und cmic.

Die infizierten Fibroblasten werden 14 bis 28 Tage lang auf embryonalen Feederzellen der Maus kultiviert. Die resultierenden Kulturen werden mit TRA 180 1 Antikörpern gefärbt, um Kolonien von reprogrammierten Zellen zu identifizieren. Positive Kolonien werden dann zur Expansion auf MEF mit Platten übertragen.

Die chemische Immunzyto-Färbung bestätigt die Expression von Pluripotenzmarkern und die Etablierung pluripotenter Stammzelllinien. Anschließend sollten weitere Studien durchgeführt werden, um die Linien weiter zu charakterisieren. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in der somatischen Zellprogrammierung und humanen induzierten pluripotenten Stammzellkulturen sind, Schwierigkeiten haben, da es schwierig ist, die richtigen IPSC-Kolonien zu identifizieren.

Das Verfahren wird von Dr. Sula Pollak, Post-Doctor O Fellow aus meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie Phoenix AM FO-Zellen mit einer Dichte von etwa sieben bis 8 Millionen Zellen pro 10-Zentimeter-Platte in 10 Milliliter DMEM-Platte mit hohem Glukosegehalt plattieren, über Nacht in den Inkubator und in die Kultur stellen. Am nächsten Tag bereiten Sie Transfektionsmischungen vor, die aus 12 Mikrogramm eines Vektors bestehen, der entweder für T, drei, vier SOX, zwei klf, vier cmic oder GFP-Gen und 35 Mikroliter für wenige Gene sechs in einem Gesamtvolumen von 500 Mikrolitern serumfreiem DMEM mit hohem Glukosegehalt und L-Glutamin kodiert.

Inkubieren Sie die Mischungen 20 Minuten lang. Um die Phönixzellen zu transfizieren, pipettieren Sie dann die DNA-Komplexe vorsichtig in die Platten mit den Phönixzellen, die zu 70 bis 80 % konfluent sein sollten. Inkubieren Sie die Zellen nach sechs bis acht Stunden bei 37 Grad Celsius.

Aspirieren Sie das Medium und ersetzen Sie es durch acht Milliliter DMEM mit hohem Glukosegehalt durch Antibiotika. Legen Sie die Platten dann nach der Inkubation für 12 Stunden in den Inkubator zurück. Verwenden Sie eine Pipette, um das virushaltige Medium abzusaugen und aufzufangen.

Tauschen Sie dann das Medium aus und wiederholen Sie diesen Vorgang alle 12 Stunden, bis das Medium viermal aufgefangen wurde. Lagern Sie das Medium bei vier Grad Celsius. Sobald das gesamte Medium aufgefangen wurde, kombinieren Sie alle Teile und gießen Sie es dann durch einen 0,45-Mikrometer-Röhrchenoberfilter in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, um abgelöste Zellen und Ablagerungen zu entfernen.

Das gefilterte Medium, das Viruspartikel enthält, kann zwei Wochen lang im Kühlschrank aufbewahrt werden, ohne seine infektiöse Aktivität zu verlieren. Einfrieren wird nicht empfohlen. Am Tag vor dem Transduktionsverfahren wird der gefrorene Bestand adulter humaner Fibroblasten aufgetaut und je nach Vertiefung von sechs Vertiefungen gelatinebeschichteten Platten einmal 10 zu den fünften Zellen hinzugefügt.

Am nächsten Tag werden in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen je 3,5 Milliliter T vier SOX zwei, klf vier und cmic virales Medium kombiniert und Polyhirn bis zu einer Endkonzentration von sechs Mikrogramm pro Liter als Kontrolle hinzugefügt. Bereiten Sie einen Milliliter GFP-Virusmedium, drei Milliliter Kultur, Medium und Polyhirn in einer Endkonzentration von sechs Mikrogramm pro Milliliter vor. Aspirieren Sie das Medium aus der Platte, die die humanen Fibroblasten enthält.

Geben Sie dann vier Milliliter gemischte virale Medien oder Kontrollmedium hinzu und zentrifugieren Sie die Platten nach der Zentrifugation eine Stunde lang bei 1600 g bei 20 Grad Celsius. Inkubieren Sie die Platten ca. 12 Stunden lang. Ersetzen Sie dann das Virusmedium durch Fibroblasten-Kulturmedium und inkubieren Sie weitere 12 Stunden.

Wiederholen Sie diesen Vorgang von der Infektion bis zur Kultur in Fibroblastenmedium zwei weitere Male nach der letzten Infektion. Kultivieren Sie die Fibroblasten 48 Stunden lang in DMEM. Überprüfen Sie dann die Wirksamkeit der Infektion der parallelen Transduktionen mit dem retroviralen GFP-Medium.

Als nächstes wird die Reprogrammierung von somatischen zu pluripotenten Zellen eingeleitet. Die infizierten Fibroblasten werden in humanen embryonalen Stammzellmedien oder HES-Medium-Samen von Mäuseembryonen, Fibroblasten oder MEFs mit einer Dichte von etwa zwei mal 10 bis fünften Zellen pro Vertiefung der behandelten Gelatine kultiviert. Sechs-Well-Platte in Fibroblasten-Wachstumsmedium am nächsten Tag.

Die infizierten humanen Fibroblasten werden mit 0,05 %-Tripsin EDTA gespalten und mit einer Dichte von etwa 1,2 mal 10 bis zum Viertel pro Vertiefung im Fibroblasten-Wachstumsmedium ausgesiedelt. Am nächsten Tag. Ersetzen Sie das Medium in den ersten sieben Tagen der Reprogrammierung durch HES-Medien mit 0,5 millimolaren Natriumbutyrat.

Wechseln Sie das Medium täglich. Ersetzen Sie das Medium durch HES-Medien ohne Natriumbutyrat und setzen Sie die Reprogrammierung für weitere sieben bis 21 Tage fort. Wechseln Sie das Medium täglich jeden Tag.

Überprüfen Sie die transduzierten Zellen auf morphologische Veränderungen. Die Zellkolonien beginnen etwa 10 Tage nach der Übertragung der transduzierten Fibroblasten auf die Feeder-Zellen zu entstehen. Die Kolonien, die die reprogrammierten Zellen enthalten, werden nun als humane induzierte pluripotente Stammzellen oder humane IPS-Zellen bezeichnet.

Die humanen IPS-Zellkolonien können in 14 bis 28 Tagen isoliert werden, nachdem sie auf den MEF-Feederzellen plattiert wurden. In diesem Stadium können hier humane IPS-Zellkolonien entweder auf MEF-haltige oder mit Matrigel bedeckte Platten übertragen werden. Der Transfer auf die MEF-haltigen Platten wird einen Tag vor der Entnahme der menschlichen IPS-Zellkolonien demonstriert. Seed 24 Well-Platten mit gammabestrahlten MEF-Feederzellen in Fibroblasten-Wachstumsmedium.

Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2 an dem Tag, an dem die menschlichen IPS-Zellkolonien entnommen werden. Aspirieren Sie das Fibroblasten-Wachstumsmedium aus den ME Fs und spülen Sie sie mit PBS aus, um alle Spuren von FBS zu entfernen. Anschließend werden 0,5 Milliliter humane embryonale Stammzellen oder HES-Medium, die 10 mikromolare Gesteinsinhibitoren Y 2 7 6 3 2 enthalten, in jede Vertiefung gegeben. Als nächstes wird mit einem Mikroskop, das in einer Laminar-Flow-Haube montiert ist, die Reprogrammierungsplatten für die Bildung der menschlichen IPS-Zellkolonie untersucht.

Falls erforderlich, entfernen Sie die Fibroblasten, die die menschlichen IPS-Zellkolonien umgeben, mit einer 21-Gauge-Nadel. Spülen Sie die Platten mit PBS aus und fügen Sie frisches HES-Medium hinzu, das den spezifischen Antikörper TRA 180 1 stain alive enthält. Bringen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2 in den Inkubator zurück.

Ersetzen Sie das Medium nach 30 Minuten durch frisches HES-Medium, das mit 10 mikromolaren Gesteinsinhibitoren ergänzt wird. Betrachten Sie dann die Kolonien unter dem Fluoreszenzmikroskop. Markieren Sie TRA mit eins bis 81 positiven Kolonien.

Verwendung eines Objektivmarkierers mit einer 21-Gauge-Nadel. Schneiden Sie die TRA 180 1 positiven humanen IPS-Zellkolonien in mehrere kleine Stücke. Als nächstes übertragen Sie mit einer automatischen Pipette Fragmente von menschlichen IPS-Zellkolonien in einzelne Vertiefungen der 24-Well-Platte mit ME Fs.Vermeiden Sie den Transfer von Nicht-IPS-Zellen.

Legen Sie die Platten in den Inkubator und lassen Sie die menschlichen IPS-Zellkolonien für 24 bis 36 Stunden täglich das Medium wechseln. Die humanen IPS-Zellkolonien mit der korrekten HE-ähnlichen Morphologie sind 48 Stunden nach dem ersten Transfer auf eine 24-Well-Platte sichtbar, wobei die humanen IPS-Zellkolonien alle sechs bis acht Tage manuell durchgelassen werden, indem sie mit einer 21-Gauge-Stichplatte geschnitten werden. Expandieren von Kulturen auf eine 12-Well-Platte und anschließend auf eine Sechs-Well-Platte nach klonaler Expansion.

Und die Etablierung der humanen IPS-Zelllinien analysiert die Expression der Pluripotenzmarker TRA eins, 60 SSEA vier, T drei, vier SOX, zwei und Nanog mithilfe der Immunchemie, sobald die Linien etabliert sind. Eine detaillierte Charakterisierung kann in vitro und in vivo erfolgen. Differenzierungsanalyse, Karyotypanalyse, Analyse von Transgen-Silencing-Methylierungsstudien und Genexpressionsstudien.

Eine effiziente Transduktion mit retrovirushaltigem Medium ist entscheidend für eine erfolgreiche Reprogrammierung, um die Wirksamkeit der viralen Transduktion zu bestimmen. Humane adulte Fibroblasten, die von einem Patienten mit Friedrichs-Ataxie stammen, wurden nach zwei aufeinanderfolgenden Infektionen mit GFP retroviralem Medium sichtbar gemacht: Wenn die Fibroblasten durch einfache Inkubation mit viralem Medium infiziert wurden, wurden weniger als 20% der Zellen transduziert. Wenn jedoch unmittelbar auf die Zugabe des GFP-retroviralen Mediums folgte, wurde die Effizienz der Transduktion drastisch erhöht.

Hier werden mehr als 80% der Zellen transduziert, um eine erste Charakterisierung der isolierten humanen IPS-Zellkolonien durchzuführen. Die Expression von Pluripotenzmarkern, die für humane ES-Zellen charakteristisch sind, wurde immunchemisch untersucht, wie hier gezeigt. Isolierte humane IPS-Zellkolonien waren positiv für die Pluripotenzmarker.

T drei vier SOX zwei Nano SSEA vier und TRA eins 60 DNA. Die auf den oberen Panels gezeigte Cos-Färbung mit DPI wird sowohl in den humanen IPS-Zellkolonien als auch in den Feeder-Zellen nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigen, dass humane IPS-Zellen, die mit diesem Reprogrammierungsprotokoll gewonnen wurden, geeignete Pluripotenzmarker exprimieren, die für undifferenzierte humane pluripotente Stammzellen charakteristisch sind.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie menschliche Fibroblasten erfolgreich in pluripotente Stammzellen umprogrammieren können, indem Sie retrovirale Transaktionen verwenden, den Menschen korrekt induzieren, pluripotente Stammzellkolonien identifizieren und eine erste Charakterisierung von HI-PCs durchführen.