Elektrophysiologische Charakterisierung von GFP-exprimierenden Zellpopulationen in der intakte Retina

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Lichtantworten und die Morphologie einzelner Neuronen in der intakten Netzhaut mithilfe einer Mauslinie zu untersuchen, die einen fluoreszierenden Marker ausschließlich in spezifischen Zelltypen exprimiert. Dies wird erreicht, indem zuerst das Auge präpariert wird, um eine isolierte Netzhaut zu erhalten. Der zweite Schritt besteht darin, die Netzhaut unter ein Laserscanningmikroskop zu legen und eine Zelle mittels Zwei-Photonen-Infrarotanregung zu visualisieren.

Mithilfe einer Mikropipette wird anschließend eine Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration zur Ableitung und Farbstofffüllung hergestellt. Letztendlich ermöglicht diese Vorbereitung die Aufzeichnung zellulärer Antworten auf photoelektrische Stimulation und zeigt die Morphologie der aufgezeichneten Zelle mittels konfokaler Mikroskopie. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der ungezielten Patch-Clamp-Ableitung aus der Retina besteht darin, dass die Ableitung visuell gezielt auf eine fluoreszenzmarkierte Zelle ausgerichtet werden kann, ohne die Retina mit Anregungslicht zu stimulieren.

Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen in der Netzhautforschung zu beantworten, beispielsweise welchen Beitrag eine gegebene Zellpopulation bei der Verarbeitung visueller Informationen leistet, selbst wenn die Zellpopulation eine geringe Dichte aufweist und keine auffälligen morphologischen Merkmale besitzt, die die Identifizierung erleichtern könnten. Beginnen Sie dieses Experiment, indem Sie die Maus mindestens drei Stunden vor dem Experiment im Dunkeln adaptieren.

Unterdessen die extrazelluläre Lösung wie in der beigefügten Publikation beschrieben vorbereiten und bei Raumtemperatur mit Carbogen durchblubbern. Anschließend das Mausopfer vollziehen und die Augen mit einer gebogenen Iris-Schere enukleieren. Diese in eine Schale mit extrazellulärer Lösung überführen.

Danach unter ein Stereomikroskop mit einer Pinzettenschere legen. Die Hornhaut und den Ziliarkörper entfernen, indem man den Augapfel entlang der Ora serrata öffnet. Die Linse entfernen und die Netzhaut vorsichtig vom Pigmentepithel abtrennen.

Danach den Sehnerv zwischen Netzhaut und Pigmentepithel durchtrennen. Die Netzhaut aus der Augenschale entfernen. Beachten Sie, dass die Innenseite der aufgerollten Netzhaut die Seite der Ganglienzellen ist.

Die Außenseite ist die Photorezeptorseite. Anschließend entfernen Sie das Glaskörpermaterial von der inneren Retinaoberfläche, indem Sie es vorsichtig mit Hilfe eines Holzstäbchens abziehen. Führen Sie danach kurze Einschnitte entlang des Retinarandes durch, um das Auffalten des Gewebes zu erleichtern.

Überführen Sie anschließend die Netzhaut mit der Photorezeptorseite nach unten in die Ableitungskammer. Breiten Sie sie mit einem feinen Pinsel auf dem Glasboden aus und fixieren Sie sie mit einem mit Nylon bespannten Rahmen aus rostfreiem Stahl. Stellen Sie die Ableitungskammer im Dunkeln unter ein aufrechtes Laser-Scanning-Mikroskop.

Überströmen Sie die Netzhautpräparation kontinuierlich mit mindestens fünf Milliliter pro Minute. Mit carbogesättigter extrazellulärer Lösung, die auf 35 Grad Celsius erhitzt ist, befindet sich das Mikroskop auf einem stoßdämpfenden Lufttisch innerhalb einer Faraday-Kammer. Zur elektronischen Abschirmung decken Sie die Kammer mit einem undurchsichtigen Vorhang ab, um die Präparation im Dunkeln zu halten.

Wir filtern das Licht von Computermonitoren außerdem mit roten transparenten Folien aus. Stimmen Sie den Infrarotlaser auf 850 bis 870 Nanometer oder längere Wellenlängen ab. Schalten Sie in den modengekoppelten Zustand und verwenden Sie die Zwei-Photonen-Anregung, um Zellen mit GFP-Expression sichtbar zu machen.

Füllen Sie für die Patch-Clamp-Aufzeichnung Borosilikatglasmikropipetten mit der intrazellulären Lösung, die eine fluoreszierende Sonde enthält, wie in der begleitenden Veröffentlichung beschrieben. Danach setzen Sie die Mikropipette in den Halter ein. Stellen Sie sicher, dass die Referenzelektrode mit der extrazellulären Lösung in der Ableitungskammer in Kontakt steht.

Als Nächstes wird Druck auf die Mikropipette ausgeübt, um eine GFP-exprimierende Zelle mittels eines 40-fachen Wasser-Immersion-Objektivs anzusteuern. Omicron-Zellkörper befinden sich in der Ganglienzellschicht sowie im proximalen Teil der Innerschicht, bevor die Mikropipette mit der Zielzelle in Kontakt tritt und die innere Begrenzungsmembran an der retinalen Oberfläche durchdringt. Ein erfolgreicher Durchtritt wird an der aus der Mikropipettenspitze austretenden intrazellulären Lösung sowie an der Ablösung der inneren Begrenzungsmembran vom darunterliegenden Retinalgewebe erkannt. Der fluoreszierende Farbstoff in der intrazellulären Lösung kann die Position der Mikropipette im Zweiphotonen-Bild anzeigen, während sie sich der gewünschten Zelle nähert.

Danach den Druck von der Mikropipette nehmen und eine Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration erhalten. Im Strom-Klemm-Modus sollte eine brauchbare Aufzeichnung ein Membranpotenzial von minus 50 bis minus 55 Millivolt aufweisen und mindestens 20 Minuten andauern. Danach die auf einem Computermonitor erzeugten visuellen Reize präsentieren.

Stellen Sie die Reizintensität ein, indem Sie Neutrale-Dichtefilter in den Strahlengang einbringen, und justieren Sie die räumliche Position der Stimulation auf das Zentrum der aufgezeichneten Zelle. Starten Sie anschließend das Stimulationsprotokoll und nehmen Sie die Lichtantworten auf. Verwenden Sie den Stimulusgenerator, um die Aufnahmesoftware auszulösen.

Platzieren Sie eine Photodiode im Strahlengang, um die Stimulus-Timing-Daten zu erfassen. Achten Sie darauf, den Zellkörper nicht herauszuziehen, wenn Sie die Mikropipette zurückziehen. Wenn die Farbstofffüllung abgeschlossen ist, lassen Sie das fluoreszierende Mittel 30 bis 45 Minuten lang in die aufgezeichnete Zelle diffundieren.

Hier ist ein Beispiel für GFP-exprimierende Zellen in einer Netzhaut-Präparat-Präparation unter ihrer Promotorregulation für Tyrosinhydroxylase. Zwei Populationen können anhand der Helligkeit des GFP-Signals unterschieden werden. Typ-eins-Dopaminerge Zellen, die sich in der inzelligulären Schicht befinden, zeigen eine schwache Fluoreszenz, wie durch die Pfeilspitzen veranschaulicht. In Abbildung A. waren Typ-zwei-Zellen intensiv markiert und besitzen Zellkörper entweder in der Schicht, wie durch Pfeile in Abbildung A gezeigt, oder sie sind in die Ganglienzellschicht verschoben, wie in Abbildung B dargestellt. Abbildung C zeigt die dendritische Stratifikation von Typ-zwei-Zellen in Schicht drei der inneren plexiformen Schicht; hier ist ein Beispiel für die Morphologie einer Typ-zwei-Zelle dargestellt, die mit dem Tracer Neurobiotin injiziert wurde.

Der Tracer wurde später durch Bindung an fluoreszenzmarkiertes Streptavidin sichtbar gemacht, das hier in Magenta dargestellt ist. Hier sind verschiedene Antwortmuster einer Typ-zwei-Zelle, die in der Ganglienzellschicht lokalisiert ist, auf weißes Licht. Zur besseren Unterscheidung der Antwortkomponenten bei Stimulus, Einsetzen und Ende des Reizes wurde ein verlängerter Reiz von drei Sekunden verwendet. Dieses Vorgehen folgte dieser Prozedur.

Andere Methoden wie pharmakologische Experimente, Kalzium-Bildgebung oder Immunchemie können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen hinsichtlich der funktionellen Rolle eines bestimmten Zelltyps in der Netzhautschaltung zu beantworten.